一種天然細胞複合生長因子的製備方法
2023-06-07 21:25:11 1
專利名稱：一種天然細胞複合生長因子的製備方法
技術領域：
本發明屬於生物組織培養技術領域，具體涉及一種天然細胞複合生長因子的製備方法。
背景技術：
體外培養的細胞可以自分泌和旁分泌胺基酸、多肽或蛋白質等細胞因子，包括生長因子、營養因子等，這些因子對多種細胞生理功能和代謝活動具有生物調節作用，在體內含量極微，但生物活性極高。這些因子能夠與存在於靶細胞上的特異受體相結合而發揮作用，其主要生物學效應為趨化誘導炎症細胞刺激靶細胞增殖和分化，促進靶細胞合成並分泌細胞外基質(如膠原等)；能夠調節T細胞、B細胞、組織細胞、朗罕氏細胞和樹突狀細胞的形成、發育及代謝功能，並影響它們的遷移和生長速率，同時也刺激結締組織、表皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞等分泌細胞因子、淋巴因子、胞外蛋白和基質多糖；對於發育成熟的組織器官、創傷後引發的器官受損、功能削弱，這些細胞分泌的因子都有顯著的修復重建功能。
迄今為止，發現的這類因子有幾十種，如胰島素樣生長因子、酸性成纖維細胞生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、轉化生長因子β、神經營養因子、血小板衍化生長因子、胚胎幹細胞營養因子等等。目前這類因子的製備主要是依靠基因工程的方法，其不足之處在於基因工程僅能製備單一類型的因子，且產品的生物活性難以達到天然產物的活性。另外，目前相關的文獻報導基本上是將細胞在培養瓶或某種基質上培養，以二維方式培養來獲取上清，採用這種方式培養的細胞與體內的生長方式有所不同，因此其所合成並分泌的蛋白質難以達到理想的生理效果，與天然物有質和量上的差別。
發明內容
本發明的目的是提出一種天然細胞複合生長因子的製備方法，使其具有周期短、成本低、方法簡便、易於操作、材料來源廣泛的優點，所獲得的細胞複合生長因子生物活性高、無過敏反應及其他副作用、安全可靠。
本發明提出的天然細胞複合生長因子的製備方法，包括有組織工程化組織的構建，其特徵在於，採用組織工程方法在體外構建人工組織器官，收集組織器官培養過程中的上清液，經分離純化後得到天然細胞複合生長因子。其組織工程化組織構建中所用細胞是來自人體按常規方法進行不同細胞的原代培養、傳代培養，並大量擴增獲取。這些細胞可以包括表皮細胞、成纖維細胞、雪旺細胞、神經細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、腺上皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、胰島細胞、肝細胞等，也可以是胚胎幹細胞或造血幹細胞，間充質幹細胞，神經幹細胞，皮膚幹細胞，血管內皮幹細胞，肝臟幹細胞、胰腺幹細胞、腸上皮幹細胞及生殖幹細胞等成體幹細胞，或是經基因工程修飾過的細胞。
本發明製備方法的具體方案如下1.組織工程化組織的構建人工構建的組織在適宜的環境下可以按照生理情況繼續生長、發育和成熟；在組織構建完成後進行組織培養，在組織生長發育的培養過程中，開始由培養液中收集上清液。組織構建和培養所用的培養液是根據所選擇的培養細胞來確定基本培養基，例如DMEM，F12，RPMI 1640，αMEM等商品化的培養基，基本培養基可根據所選擇培養細胞的養分需求添加其他輔助成分，包括血清、生長促進劑或生長抑制劑、維生素等；其組織培養的方式採用已有培養技術，包括液下培養、氣液面培養、旋轉培養或生物反應器等方法進行培養。
2.上清液的分離和純化收集上述培養過程中的上清液採用目前已知的蛋白質分離純化的技術方法；上清液的濃縮可採用中空纖維柱或切向流超濾方法，同時濾去低分子量代謝產物和鹽類；上清液內蛋白質的分離和純化，可採用透析、超濾、鹽析、電泳、吸附層析、薄層層析、聚焦層析、凝膠層析、離子交換凝膠層析、親和層析、氣相色譜、高效液相色譜和疏水作用色譜等任一種或多種方法的聯合應用，所得到的蛋白組成為一種或幾種的混合物，稱為天然細胞複合生長因子。提純後將其冷凍乾燥，可在4℃下長期儲存。
3.天然細胞複合生長因子的應用天然細胞複合生長因子可製備成包括水劑、油劑、粉劑等各種劑型，作為添加劑用於細胞培養、化妝品、食品、藥品等方面。
本發明組織工程技術是將體外大量擴增的細胞與生物材料相複合，構建三維組織器官的方法，在組織器官的培養過程中，通過細胞-細胞和細胞-細胞外基質的相互作用，合成並分泌大量的複合生長因子；在培養組織器官內含有兩種或兩種以上細胞時，不同細胞間也會產生相互作用，類似於體內組織的生長發育狀況，最終會形成成熟的組織器官，並以生理速度和濃度分泌大量的生長因子和其他蛋白到培養基中。因此用這種方式合成的生長因子將完全是天然的組分和比例，可以同時收穫多種因子，其效率和活性優於人工合成的基因產品。所以收集組織器官的培養液並進行分離和提純，可以獲得大量的細胞合成並分泌的因子，包括許多已知和未知的生長因子和營養因子，甚至包括胚胎來源的營養因子；同時所獲得的因子則是天然組成，這也是人工方法無法達到的效果。
本發明所製備的天然細胞複合生長因子具有極高的生物活性，是多種細胞生長因子和/或營養因子的混合。經實驗表明，具有顯著誘導血管新生、加快創面修復速度、減少瘢痕形成、提高癒合質量的作用，表現為創面肉芽組織生成增多、增厚，創面膠原合成增加，創面再上皮化速度加快，成纖維細胞成熟加快且數量增多，毛細血管增加，局部循環改善及癒合時間縮短等；本發明所製備的天然細胞複合生長因子來自人體，無過敏反應及其他副作用。並且本發明製備方法具有周期短、成本低、方法簡便、易於操作、材料來源廣泛、安全性高的優點。
具體實施例方式
實施例1.
以皮膚組織的氣液面培養獲取上清液舉例說明本發明的實施方式。
1.無菌條件下將膠原蛋白、透明質酸、硫酸軟骨素按照9∶1∶1的重量比例混合，用0.1％的醋酸溶液按重量比配製成6％的溶液(可在1～10％範圍內選)，再按其體積的10％加入胎牛血清和10mg/ml的DMEM培養基，調節pH值為7.4，加入體外培養的5～40代人成纖維細胞懸液，使終濃度為105個細胞/ml，置於CO2孵箱中37℃固化30分鐘後，加入含10％胎牛血清的DMEM培養液培養，每天換液。
2.培養3天後，在其表面按104個細胞/cm2將體外培養的5～40代的人表皮細胞種植，繼續培養，每天換液，4天後形成皮膚組織。
3.開始每天收集上清液，將上清液在4℃條件下採用0.22μm的濾膜初步過濾，再用中空纖維柱系統濃縮至1/10體積，將濃縮樣品在4℃條件下加入Sephacryl S-200凝膠層析柱，用0.01M的PB緩衝液(pH7.0)洗脫，用280nm紫外光實時檢測，自動分布收集蛋白峰，凍幹。
將獲得的不同分子量蛋白按不同用途進行組合形成所需的產品。
實施例2.
以成纖維細胞和表皮細胞在生物反應器中培養舉例說明本發明實施方式。
1.在旋轉式培養裝置(一種密閉圓柱狀培養瓶，通過外力使培養瓶軸向以20～40轉/分鐘的速度旋轉的培養系統，為已有技術裝置)中加入含10％胎牛血清的DMEM培養液和體外培養的人成纖維細胞，並按5mg～40mg/ml的比例加入微載體(直徑60-250μm)進行旋轉培養，成纖維細胞貼附在微載體上生長並增殖，形成以微載體為核心的成纖維細胞團；2.培養5天後，在培養裝置中加入體外培養的表皮細胞，使用表皮細胞培養液培養3天，表皮細胞包裹成纖維細胞團形成多個小皮膚組織；3.開始收集上清液，將每天收取的上清液在4℃條件下使用0.22μm的濾膜初步過濾，再用切向流超濾系統濃縮，其過濾系統截留分子量為1000～3000K道爾頓，濃縮至液體體積的1/10，然後將濃縮樣品在4℃條件下加入高效液相色譜分析儀進行蛋白檢測分離，收集分離獲得的蛋白峰，凍幹。
將獲得的不同分子量蛋白按不同用途進行組合形成所需產品。
實施例3.
以骨髓間充質幹細胞與細胞外基質的培養舉例說明本發明的實施方式。
1.在無菌條件下，將細胞外基質(為各型膠原的混合物，與實例1相同)與0.1％的醋酸溶液按重量比配製成1％的溶液，加入1/10體積的胎牛血清、10mg/ml的DMEM培養液，調節pH值至7.2，加入體外培養的5～40代骨髓間充質幹細胞懸液，使終濃度為105個細胞/ml，置於37℃的CO2孵箱中固化30分鐘後，加入培養液培養，每天換液。
2.開始每天收集上清液，將收穫的上清液在4℃條件下使用0.22μm的濾膜過濾，再用中空纖維柱系統濃縮至液體體積的1/10，然後將濃縮樣品在40℃條件下加入離子交換層析柱，用0.01M的PB緩衝液(pH7.0)洗脫，用280nm紫外光實時檢測，自動分布收集蛋白峰，凍幹。
將獲得的不同分子量蛋白按不同用途組合形成所需的產品。
權利要求
1.一種天然細胞複合生長因子的製備方法，包括有組織工程化組織的構建，其特徵在於，採用組織工程方法在體外構建人工組織器官，收集組織器官培養過程中的上清液，經分離純化後得到天然細胞複合生長因子。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，製備的具體步驟為，①.構建組織工程化組織，構建完成後進行組織培養，並開始由培養液中收集上清液，組織構建和培養所用的培養液，是根據所選擇的培養細胞來確定基本培養基和需添加的其他輔助成分；②.將收集的上清液採用中空纖維柱或切向流超濾方法濃縮，同時濾去低分子量代謝產物和鹽類；採用蛋白質分離純化方法將上清液內蛋白質分離和純化，所得到的蛋白組成為天然細胞複合生長因子，提純後將其冷凍乾燥，在4℃下儲存。
3.按照權利要求1所述製備方法獲得的天然細胞複合生長因子的用途，其特徵在於，所述的天然細胞複合生長因子能製成水劑、油劑、粉劑的劑型，作為添加劑用於細胞培養、化妝品、食品、藥品方面。
全文摘要
一種天然細胞複合生長因子的提取方法。本發明通過採用組織工程方法在體外構建人工組織器官，收集組織器官培養過程中的上清液，經分離純化後得到天然細胞複合生長因子。獲得組織或器官培養過程中細胞合成並分泌的大量胺基酸或蛋白質，包括生長因子、營養因子等，分離純化後可用於細胞培養、化妝品、食品、藥品等方面。
文檔編號C12N5/06GK1958793SQ20061010495
公開日2007年5月9日 申請日期2006年11月23日 優先權日2006年11月23日
發明者張勇傑, 金巖 申請人:西安組織工程工程技術研究中心