一種可抑制hiv-1反轉錄酶的蟬花蛋白酶及製備方法

2023-06-08 00:07:31

專利名稱：一種可抑制hiv-1反轉錄酶的蟬花蛋白酶及製備方法
技術領域：
本發明涉及一種可抑制HIV-I反轉錄酶的蟬花蛋白酶及製備方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
蛋白酶是催化蛋白質水解反應的酶，能作用於蛋白質分子中的肽鍵，形成長度較短的肽鏈或是胺基酸。蛋白酶廣泛存在於生物體內，對蛋白質的新陳代謝起調節作用，從細胞、器官、機體等各個水平上發揮各種各樣的功能。蛋白酶種類繁多，應用領域也十分廣泛， 主要涉及到去汙劑、皮革、紡織、食品、醫藥、環保與資源等多方面。近年來，隨著生物學研究技術的發展，開發蛋白酶資源，尋找新的高品質的蛋白酶一直是各國研究人員關注的焦點。蟬花(Cordyc印s sobolifera)又名蟬蛹草、蛹茸、蟲花，是麥角菌科真菌大蟬草 (蟬擬青黴)及其寄主山蟬若蟲的乾燥體。醫學上認為，蟬花是一種與冬蟲夏草相近的珍貴藥材。蟬花中分離的蟬擬青黴具有極為廣譜並具較強的致病性，可以寄生鱗翅目、膜翅目中的很多昆蟲，在害蟲防治上顯示很大的優越性，其作用機制可認為是菌絲體分泌蛋白酶侵染蟲體，利用其中的蛋白養分完成生活史。愛滋病是嚴重威脅人類健康的病毒性傳染病。愛滋病病毒HIV屬於反轉錄病毒科的慢病毒亞科。反轉錄是HIV病毒最重要的特徵之一，其過程就是在病毒體內反轉錄酶的作用下以病毒RNA為模板合成病毒DNA的過程。在反轉錄過程中，反轉錄酶起著重要作用， 這也是研究抗愛滋病藥物的最佳靶點之一，目前正在研製的大部分藥物都是以HIV的反轉錄為靶點的。Mitsuya等首先發現脫氧胸苷類AZT具有顯著的抑制愛滋病病毒的作用，隨後研究又陸續發現脫氧核苷、無環核苷、核苷類似物能有效的抑制HIV的複製，但這些抑制劑的耐藥問題日益突出，並且具有嚴重的毒副作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有抑制HIV-I反轉錄酶活性的蟬花蛋白酶及其製備方法。本發明提供的蟬花蛋白酶，其製備方法包括以下步驟1)破碎蟬花細胞；2)收集蛋白粗提物；幻從步驟幻中收集的蛋白粗提物中分離純化蛋白酶，得到的蛋白酶即為蟬花提取物，所述蛋白酶的分子量為31KD且N末端序列見序列表序列1。所述蛋白酶為絲氨酸族蛋白酶，所述蛋白酶在如下條件下酶的活力最高pH值為 12-12. 5、溫度為 55-650C ο所述破碎蟬花細胞可為破碎蟬花子實體的細胞。所述步驟2)中，採用離心的方式收集蛋白粗提物，所使用的離心力為 6010-15151g，具體為 12000g。從步驟2~)收集的蛋白粗提物中分離純化蛋白酶包括如下a) c)三步a)將從步驟幻收集的蛋白粗提物進行陰離子交換柱層析，收集具有蛋白酶活性
4的洗脫峰；所述陰離子交換柱層析中所採用的陰離子交換基團是DEAE，用pH8. 9-9. 9的碳酸氫銨緩衝溶液進行洗脫；所述碳酸氫銨緩衝溶液的溶質為9. 5-10. 5mM NH4HCO3,溶劑為水，用氨水調pH;b)將從步驟a)獲得的洗脫峰進行陽離子交換柱層析，收集具有蛋白酶活性的洗脫峰；所述陽離子交換柱層析中所採用的陽離子交換基團是SP，所採用的洗脫程序為進行 NaCl線性洗脫，所述NaCl線性洗脫中所用的NaCl線性洗脫液的pH值為4. 5-5. 5，溶質為 NaCl，溶劑為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液；所述線性洗脫的時間是150分鐘，所述線性洗脫中NaCl的濃度在150分鐘內由OM線性升至0. 8M ；所述檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液的溶質為4. 0-5. OmM檸檬酸和5. 0-6. OmM檸檬酸鈉，溶劑為水；c)將從步驟b)獲得的洗脫峰進行凝膠過濾層析，得到具有蛋白酶活性的洗脫峰； 所述凝膠過濾層析所用層析介質的分離範圍包括31KD，所用的層析柱的柱長度和柱內徑比為 25 1-50 1。所述步驟a)陰離子交換柱層析的載體為Cellulose，所述步驟b)陽離子交換柱層析的載體為kpharose，所述步驟c)凝膠過濾層析的介質為Superdex 75。所述步驟a)中洗脫用pH9. 4的所述碳酸氫銨緩衝溶液洗脫；所述碳酸氫銨緩衝溶液的溶質為IOmM碳酸氫銨，溶劑為水，用氨水調pH ；所述步驟b)中所述NaCl線性洗脫中所用的NaCl線性洗脫液的pH值為5. 0，所述檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液的溶質為4. ImM檸檬酸和5. 9mM檸檬酸鈉，溶劑為水；所述步驟C)中所述得到具有蛋白酶活性的洗脫峰是用如下溶液洗脫得到的pH 值為8. 5的0. 2M的NH4HCO3水溶液。所述步驟C)所用的層析柱的柱長度和柱內徑比為30 1。本發明提供的蟬花提取物，其分子量為31KD且N末端序列見序列表序列1 ；所述蛋白酶為絲氨酸族蛋白酶，所述蛋白酶在如下條件下酶的活力最高PH值為12-12. 5、溫度為 55-65 0C ο所述的蟬花提取物在製備下述任一產品中的應用也是本發明的保護範圍A)抑制HIV-I反轉錄酶活性的產品；B)改善愛滋病患者健康狀況的產品。依據本發明的製備方法所獲得的蟬花蛋白酶對HIV反轉錄酶活性有非常明顯的抑制作用，是以一種新型的抗病毒抑制劑，在抗愛滋病新藥研究領域中具有重要價值。


圖1為DEAE-Cellulose弱陰離子交換柱層析洗脫圖譜。圖2為SP-S印harose強陽離子交換柱層析洗脫圖譜。圖3為FPLC-Superdex 75凝膠過濾層析洗脫圖譜。圖4為蟬花蛋白酶SDS-PAGE電泳鑑定圖譜。標準分子量M(購自GE Healthcare 公司)從上到下依次為磷酸化酶b(94KD)，牛血清白蛋白(67KD)，卵清蛋白(43KD)，碳酸酐酶(30KD)，大豆胰島素抑制劑(20KD)，乳白蛋白(14.4KD) ；P為蟬花蛋白酶。圖5為蟬花蛋白酶在不同反應溫度下的相對酶活力。圖6為蟬花蛋白酶經不同溫度處理40min後的相對酶活力。圖7為蟬花蛋白酶在不同pH條件下的相對酶活力。
圖8為不同劑量蟬花蛋白酶對HIV-I反轉錄酶的抑制率。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、蟬花(Cordyc印s sobolifera)蛋白酶的分離純化與鑑定1、提取與粗級分離用0. 15M 的 NaCl 溶液懸浮蟬花(Cordyceps sobolifera) (Liu, Ζ. -Y.，Liang, Ζ. Q. , Whalley, A. J. S. , Liu, A. -Y. & Yao*, Y. -J. A new species of Beauveria, the anamorph of Cordyceps sobolifera. Fungal Diversity, 2001,7 :61-70.公眾可從北京市農林科學院獲得)子實體，利用組織搗碎機進行組織破碎至子實體為糊狀，4°C條件下放置12小時後，SOOOrpm(12000g)離心15min，收集上清溶液，得到粗提液；向粗提液中加入 (NH4)2SO4至80%飽和度，於4°C條件下靜置4小時，8000rpm(12000g)離心15min,收集沉澱，得到蛋白粗提物，蒸餾水溶解蛋白粗提物沉澱並在蒸餾水中透析12-16小時。2、離子交換柱層析分離純化層析柱利用相應的緩衝溶液以^il/min的流速平衡8_10個柱體積後，利用pH計測定層析柱流出液的PH值以確定層析柱是否平衡好，透析後的蛋白粗樣品以1.5ml/min的流速勻速上樣，待樣品上完後，將流速調製2. 5ml/min(SP-kphar0Se層析為lml/min)進行洗脫，各洗脫峰利用蛋白酶活性檢測方法確定是否為活性峰。DEAE-Cellulose層析柱洗脫時選用添加0、0. IM和IM NaCl進行分步洗脫； SP-Sepharose層析柱洗脫時選用添加0_0. 8M NaCl進行線性洗脫。(I)DEAE-Cellulose弱陰離子交換柱層析透析後的蛋白粗提物經過pH9. 4的碳酸氫銨緩衝溶液(溶質為IOmM NH4HCO3，用氨水調PH，溶劑為水)平衡後，經DEAE-Cellulose (Sigma公司，D0909)弱陰離子交換柱層析。 該離子交換柱的柱體積為100ml。進行三步洗脫，流速2. 5ml/min。第一步洗脫用pH9. 4的碳酸氫銨緩衝溶液(溶質為IOmM NH4HCO3，用氨水調pH，溶劑為水)洗脫2個柱體積；第二步洗脫用PH9. 4的如下溶液洗脫1. 5個柱體積溶質是0. IM NaCl，溶劑是碳酸氫銨緩衝溶液(溶質為IOmM NH4HCO3，用氨水調pH，溶劑為水)；第三步洗脫用pH9. 4的如下溶液洗脫 1. 3個柱體積溶質是1. OM NaCl，溶劑是碳酸氫銨緩衝溶液(溶質為IOmM NH4HCO3,用氨水調PH，溶劑為水)。收集得到的洗脫峰進行蛋白酶活性檢測，結果表明第一步洗脫得到的第一洗脫峰 Dl (圖1中洗脫體積為第40-120ml，即第0. 4-1. 2個柱體積)為目標提取物的活性峰(其蛋白酶活性為1949. 83U/mg)，將Dl活性峰在蒸餾水中透析10-12小時。(2) SP-Sepharose強陽離子交換柱層析進行SP-S印harose (GE Healthcare公司，17_07四-10)強陽離子交換柱層析。先用PH 5. 0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液(溶質為4. ImM檸檬酸和5. 9mM檸檬酸鈉，溶劑為水)平衡離子交換柱(該離子交換柱的柱體積為10ml)，將Dl組分上樣，再用100ml pH 5.0 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液(溶質為4. ImM檸檬酸和5. 9mM檸檬酸鈉，溶劑為水)平衡， 流速lml/min。然後，再進行150分鐘的NaCl線性洗脫，流速lml/min。該NaCl線性洗脫溶液PH值為5. 0，溶質為NaCl，溶劑為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液(溶質為4. ImM檸檬酸和5. 9mM檸檬酸鈉，溶劑為水)，NaCl的濃度在150分鐘內由OM線性升至0. 8M。收集得到的洗脫峰進行蛋白酶活性檢測，結果表明得到的第三洗脫峰SP3 (圖2中洗脫體積為第160-180ml，即第16-18個柱體積)為目標提取物的活性峰(該活性峰的蛋白酶活性為36395. 35U/mg)，將SP3活性峰在蒸餾水中透析10-12小時。3、凝膠過濾層析SP3 組分經 FPLC-Superdex 75 (GE Healthcare 公司，17-5174-01)凝膠過濾層析， 洗脫液為PH8. 5 0. 2M NH4HCO3溶液，層析柱規格30cm(柱長)X lcm(內徑)，上樣體積為 0. anl，流速為0. Sml/min。收集得到的洗脫峰進行蛋白酶活性檢測，結果表明得到的第一洗脫峰SUl (圖3中洗脫體積為第11. 2-14. 4ml,即第0. 47-0. 61個柱體積)為目標提取物的活性峰(該活性峰的蛋白酶活性為56780. 98U/mg)。經過陰、陽離子交換柱層析和凝膠過濾層析，以25g幹蟬花子實體為材料，得到純化的蟬花蛋白酶活性為56780. 98U/mg,回收率為7. 37% (表1)。表1蟬花蛋白酶回收率與純化倍數幹蟬花子實體)
權利要求
1.蟬花(Cordyc印ssobolifera)提取物的製備方法，包括以下步驟1)破碎蟬花細胞；2)收集蛋白粗提物；3)從步驟幻收集的蛋白粗提物中分離純化蛋白酶，得到的蛋白酶即為蟬花提取物，所述蛋白酶的分子量為31KD且N末端序列見序列表中序列1。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述蛋白酶為絲氨酸族蛋白酶。
3.根據權利要求1或2所述的製備方法，其特徵在於所述蛋白酶在如下條件下酶的活力最高PH值為12-12. 5、溫度為55-650C ο
4.根據權利要求1-3中任一所述的製備方法，其特徵在於所述從步驟幻收集的蛋白粗提物中分離純化蛋白酶包括如下步驟a)將從步驟幻收集的蛋白粗提物進行陰離子交換柱層析，收集具有蛋白酶活性的洗脫峰；所述陰離子交換柱層析中所採用的陰離子交換基團是DEAE，用pH8. 9-9. 9的碳酸氫銨緩衝溶液洗脫；所述碳酸氫銨緩衝溶液的溶質為9. 5-10. 5mM碳酸氫銨，溶劑為水；b)將從步驟a)獲得的洗脫峰進行陽離子交換柱層析，收集具有蛋白酶活性的洗脫峰； 所述陽離子交換柱層析中所採用的陽離子交換基團是SP，所採用的洗脫程序為進行NaCl 線性洗脫，所述NaCl線性洗脫中所用的NaCl線性洗脫液的pH值為4. 5-5. 5，溶質為NaCl， 溶劑為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液；所述線性洗脫的時間是150分鐘，所述線性洗脫中 NaCl的濃度在150分鐘內由OM線性升至0. 8M ；所述檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液的溶質為 4. 0-5. OmM檸檬酸和5. 0-6. OmM檸檬酸鈉，溶劑為水；c)將從步驟b)獲得的洗脫峰進行凝膠過濾層析，得到具有蛋白酶活性的洗脫峰；所述凝膠過濾層析所用層析介質的分離範圍包括31KD，所用層析柱的柱長度和柱內徑比為 25 1-50 1。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述步驟a)陰離子交換柱層析的載體為Cellulose，所述步驟b)陽離子交換柱層析的載體為kpharose，所述步驟c)凝膠過濾層析的介質為Superdex 75。
6.根據權利要求4或5所述的製備方法，其特徵在於所述步驟a)中洗脫用pH9. 4的所述碳酸氫銨緩衝溶液洗脫；所述碳酸氫銨緩衝溶液的溶質為IOmM碳酸氫銨，溶劑為水，用氨水調pH;所述步驟b)中所述NaCl線性洗脫中所用的NaCl線性洗脫液的pH值為5. 0，所述檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝溶液的溶質為4. ImM檸檬酸和5. 9mM檸檬酸鈉，溶劑為水；所述步驟c)中所述得到具有蛋白酶活性的洗脫峰是用如下溶液洗脫得到的pH值為 8. 5的0. 2M的NH4HCO3水溶液。
7.根據權利要求4-6中任一所述的製備方法，其特徵在於所述步驟c)所用的層析柱的柱長度和柱內徑比為30 1。
8.由權利要求1-7中任一所述的製備方法得到的提取物。
9.根據權利要求8所述的提取物，其特徵在於所述提取物的分子量為31KD且N末端序列見序列表序列1 ；所述提取物為絲氨酸族蛋白酶；所述提取物在如下條件下酶的活力最高:pH值為12-12. 5、溫度為55-650C。
10.權利要求8或9所述的提取物在製備下述任一產品中的應用Α)抑制HIV-I反轉錄酶活性的產品； B)改善愛滋病患者健康狀況的產品。
全文摘要
本發明公開了一種可抑制HIV-1反轉錄酶的蟬花(Cordyceps sobolifera)蛋白酶及製備方法，包括以下步驟1)破碎蟬花細胞；2)收集蛋白粗提物；3)從步驟2)收集的蛋白粗提物中分離純化蛋白酶，得到的蛋白酶即為蟬花提取物，所述蛋白酶的分子量為31KD，N末端胺基酸序列見序列表序列1，屬於絲氨酸族蛋白酶，在如下條件下酶的活力最高pH值為12-12.5、溫度為55-65℃。依據本發明的製備方法所獲得的蟬花提取物對HIV-1反轉錄酶有極其明顯的抑制作用，在抗愛滋病新藥研究領域中具有重要價值。
文檔編號C12R1/79GK102268422SQ20111018796
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月6日 優先權日2011年7月6日
發明者劉宇, 孟莉莉, 張國慶, 王蘭青, 王守現, 王賀祥, 耿小麗, 許峰, 趙爽 申請人:中國農業大學, 北京農學院, 北京市農林科學院