用於T－A克隆的pG7X－T載體及其製備方法

2023-05-29 02:55:11 1

專利名稱：用於T－A克隆的pG7X－T載體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及質粒載體的構建，具體地講，是將質粒pG7X改造成線性化以後帶有dT末端，使之成為能克隆PCR產物和含有dA末端DNA片段的T載體。
背景技術：
在分子生物學和基因工程研究中，PCR是一項廣泛用於體外擴增特異DNA片段的基本技術，而將PCR產物成功地克隆到特定載體並進行轉化和表達，是目前研究基因或DNA片段的必經之路。為了解決這一問題，近年來發展了T-A克隆技術，即利用Taq DNA聚合酶非模板依賴型末端轉移酶活性，能在PCR產物的3′端加上一個dA的特點，使PCR產物與具有一個3′dT突出末端的T載體連接，然後轉化受體細胞，使PCR產物得到高效快速克隆。這項技術有效地克服了傳統克隆技術很多固有的缺點，如載體容易自連，克隆效率低，篩選陽性克隆難度大，實驗費用高等。其中快速、簡便、經濟地製備T載體成為有效利用該克隆技術的關鍵之一。
目前T載體售價大多偏高，如1微克的Promega公司的pGEM-T載體和pGEM-T Easy載體的售價分別在700元和800元左右，1微克的TaKaRa公司的pMD18-T載體的售價在500元左右。國內幾家公司開發的產品，售價也在200元以上，而且存在連接效率低、連接不穩定等缺陷。因此製備高質量、穩定、價廉的T載體是廣大分子生物學研究者關心的問題，也是生物試劑廠商感興趣的業務之一。
目前T載體的構建方法主要有兩種第一種方法是用產生平末端的限制性內切酶(如EcoRV)在質粒DNA多克隆位點處切開，利用Taq DNA聚合酶非模板擴增特性在線性質粒兩條鏈的3′端添加dT製成T載體(Harwood A J.Methods in Molecular Biology.Human Press，1994，3119-33；奧斯伯·布倫特等主編，顏子穎、王海林譯，精編分子生物學實驗指南，第3版，科學出版社，1998，616-618)，如Promega和TaKaRa公司的產品，以及國內幾家公司的產品。該方法存在很多缺點，如載體平末端加dT效率低，而且連接不穩定，載體在克隆過程中自身環化率較高，必然增加篩選陽性克隆的難度。此外，用該方法生產的T載體產量有限，不適合大規模生產，還容易造成批次間質量差異大，在普及上存在一定困難(陸哲明，柯楊.北京大學學報[醫學版]，2002，34(6)726-728)。
第二種方法是在質粒的多克隆位點引入特殊序列，利用限制性內切酶(如XcmI、AspEI、HphI等)酶切即可直接產生T載體(Jooyeun C，William B，Srinivasn C.Gene，1993，136369-370；Ichihara Y，Kurosawa Y.Gene，1993，130153-154；Schutte B C，Ranade K，Pruessner J，et al.BioTechniques，1997，2240-44)。該方法雖然成本稍高(原因是所使用的限制性內切酶價格較高)，但製備更快捷(只需酶切，回收片段即是穩定的T載體，不必額外進行加尾反應)，更高效(通過酶切反應在3′端產生單個T突出末端更徹底)，更穩定(通過酶切加尾更容易，產品性能穩定)，產品的質量檢測指標更直觀可靠(只需要跑瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否充分)。因此，限制性內切酶法以其簡便、快速、穩定、實用的優點，在T載體構建領域中具有良好的應用前景。

發明內容
針對上述情況，本發明在不影響質粒編碼的β-半乳糖苷酶活力的情況下，改造Promega公司的商品質粒pGEM7Zf(+)，通過PCR擴增在質粒中增加有用的酶切位點，產生新質粒pG7X，該質粒經過限制性內切酶XcmI消化以後，進行瓊脂糖凝膠電泳，回收的2989鹼基對DNA片段，即是含有3′dT粘性末端、可用於PCR產物和其它帶有dA末端DNA片段克隆的T載體，命名為pG7X-T。這種T載體具有穩定的3′dT粘性末端、連接效率高、製備簡便等優點，克服了商品化T-A克隆系統售價高、批次間質量不穩定以及無法進行循環使用等缺點。
本發明用於T-A克隆的pG7X-T載體DNA序列如下0001 GACTGGGGA TCCGGAGAGC TCCCAACGCG TTGGATGCAT AGCTTGAGTA TTCTATAGTG TCACCTAAAT AGCTTGGCGT AATCATGGTCTCTGACCCCT AGGCCTCTCG AGGGTTGCGC AACCTACGTA TCGAACTCAT AAGATATCAC AGTGGATTTA TCGAACCGCA TTAGTACCAG0091 ATAGCTGTTT CCTGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG TGTAAAGCCT GGGGTGCCTATATCGACAAA GGACACACTT TAACAATAGG CGAGTGTTAA GGTGTGTTGT ATGCTCGGCC TTCGTATTTC ACATTTCGGA CCCCACGGAT0181 ATGAGTGAGC TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC CAGCTGCATT AATGAATCGGTACTCACTCG ATTGAGTGTA ATTAACGCAA CGCGAGTGAC GGGCGAAAGG TCAGCCCTTT GGACAGCACG GTCGACGTAA TTACTTAGCC0271 CCAACGCGCG GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCGGGTTGCGCGC CCCTCTCCGC CAAACGCATA ACCCGCGAGA AGGCGAAGGA GCGAGTGACT GAGCGACGCG AGCCAGCAAG CCGACGCCGC0361 AGCGGTATCA GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCATCGCCATAGT CGAGTGAGTT TCCGCCATTA TGCCAATAGG TGTCTTAGTC CCCTATTGCG TCCTTTCTTG TACACTCGTT TTCCGGTCGT0451 AAAGGCCAGG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCTCAAGTTTCCGGTCC TTGGCATTTT TCCGGCGCAA CGACCGCAAA AAGGTATCCG AGGCGGGGGG ACTGCTCGTA GTGTTTTTAG CTGCGAGTTC0541 TCAGAGGTGG CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC TCTCCTGTTC CGACCCTGCCAGTCTCCACC GCTTTGGGCT GTCCTGATAT TTCTATGGTC CGCAAAGGGG GACCTTCGAG GGAGCACGCG AGAGGACAAG GCTGGGACGG0631 GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC GTGGCGCTTT CTCATAGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGGTGTAGGTCGAATGGCCT ATGGACAGGC GGAAAGAGGG AAGCCCTTCG CACCGCGAAA GAGTATCGAG TGCGACATCC ATAGAGTCAA GCCACATCCA0721 CGTTCGCTCC AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC TATCGTCTTG AGTCCAACCCGCAAGCGAGG TTCGACCCGA CACACGTGCT TGGGGGGCAA GTCGGGCTGG CGACGCGGAA TAGGCCATTG ATAGCAGAAC TCAGGTTGGG0811 GGTAAGACAC GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAACCATTCTGTG CTGAATAGCG GTGACCGTCG TCGGTGACCA TTGTCCTAAT CGTCTCGCTC CATACATCCG CCACGATGTC TCAAGAACTT0901 GTGGTGGCCT AACTACGGCT ACACTAGAAG AACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC TTCGGAAAAA GAGTTGGTAGCACCACCGGA TTGATGCCGA TGTGATCTTC TTGTCATAAA CCATAGACGC GAGACGACTT CGGTCAATGG AAGCCTTTTT CTCAACCATC0991 CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGGT TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC AGAAAAAAAG GATCTCAAGAGAGAACTAGG CCGTTTGTTT GGTGGCGACC ATCGCCACCA AAAAAACAAA CGTTCGTCGT CTAATGCGCG TCTTTTTTTC CTAGAGTTCT1081 AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC ATGAGATTAT CAAAAAGGATTCTAGGAAAC TAGAAAAGAT GCCCCAGACT GCGAGTCACC TTGCTTTTGA GTGCAATTCC CTAAAACCAG TACTCTAATA GTTTTTCCTA1171 CTTCACCTAG ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA TCAATCTAAA GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT ACCAATGCTTGAAGTGGATC TAGGAAAATT TAATTTTTAC TTCAAAATTT AGTTAGATTT CATATATACT CATTTGAACC AGACTGTCAA TGGTTACGAA1261 AATCAGTGAG GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT TCATCCATAG TTGCCTGACT CCCCGTCGTG TAGATAACTA CGATACGGGATTAGTCACTC CGTGGATAGA GTCGCTAGAC AGATAAAGCA AGTAGGTATC AACGGACTGA GGGGCAGCAC ATCTATTGAT GCTATGCCCT1351 GGGCTTACCA TCTGGCCCCA GTGCTGCAAT GATACCGCGA GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA GCAATAAACC AGCCAGCCGGCCCGAATGGT AGACCGGGGT CACGACGTTA CTATGGCGCT CTGGGTGCGA GTGGCCGAGG TCTAAATAGT CGTTATTTGG TCGGTCGGCC1441 AAGGGCCGAG CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA GCTAGAGTAA GTAGTTCGCCTTCCCGGCTC GCGTCTTCAC CAGGACGTTG AAATAGGCGG AGGTAGGTCA GATAATTAAC AACGGCCCTT CGATCTCATT CATCAAGCGG1531 AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTACAGGC ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTTCTCAATTATCA AACGCGTTGC AACAACGGTA ACGATGTCCG TAGCACCACA GTGCGAGCAG CAAACCATAC CGAAGTAAGT CGAGGCCAAG1621 CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC AAAAAAGCGG TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG ATCGTTGTCA GAAGTAAGTTGGTTGCTAGT TCCGCTCAAT GTACTAGGGG GTACAACACG TTTTTTCGCC AATCGAGGAA GCCAGGAGGC TAGCAACAGT CTTCATTCAA1711 GGCCGCAGTG TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT AATTCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG TGACTGGTGACCGGCGTCAC AATAGTGAGT ACCAATACCG TCGTGACGTA TTAAGAGAAT GACAGTACGG TAGGCATTCT ACGAAAAGAC ACTGACCACT
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2.HindIII酶切產物的環化回收的DNA酶切片段加入到含T4 DNA連接酶的溶液中，12℃保溫過夜，進行連接，實現自身環化。10微升連接體系為240納克的DNA片段，1微升的緩衝液，350單位的T4DNA連接酶。
3.連接DNA轉化大腸桿菌用標準的氯化鈣處理法製備E.coli DH5α感受態細胞，將連接物轉化進感受態細胞E.coliDH5α，然後塗於含50微克/毫升氨苄青黴素，表面均勻地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩爾/升的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培養16小時後，選取藍色菌落。
4.菌落的PCR篩選隨機挑選一定數目的藍色菌落，以pG7X-F2/pG7X-R2為引物進行菌落PCR。15微升擴增體系中，含4.5皮摩爾的pG7X-F2，4.5皮摩爾的pG7X-R2，0.5單位的rTaq DNA聚合酶，1.5微升的rTaq-緩衝液、1.2微升的dNTPs(每種dNTP的濃度為2.5毫摩爾/升)。反應循環為94℃預熱10分鐘後，經35個反應循環(94℃ 40秒，60℃ 32秒，72℃ 200秒)，然後在72℃下保溫7分鐘，最後保存在4℃，通過瓊脂糖電泳篩選含有3千鹼基對擴增產物的陽性菌落。
5.陽性菌的進一步篩選和鑑定將上一步篩選得到的陽性菌分別劃線挑選單菌落，接種於10毫升含50微克/毫升氨苄青黴素的液體LB培養基中過夜培養，用標準的鹼裂解法提取其質粒DNA，0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測。然後對質粒DNA進行PCR鑑定，方法同步驟4。
6.用限制性內切酶SmaI和XcmI酶切鑑定上一步提取的質粒DNA進行酶切和瓊脂糖凝膠電泳，應產生3千鹼基對DNA片段，見圖3M為DNA分子量標準物λ-EcoT14I digest，1、2、3及4為不同的克隆。酶切體系(1)5單位的SmaI酶，1微升的牛血清白蛋白，1微升的緩衝液T，200納克的DNA，補水至10微升，30℃酶切過夜；(2)2.5單位的XcmI酶、1微升的緩衝液N，200納克的DNA，補水至10微升，37℃酶切過夜。SmaI購自大連寶生物公司，XcmI購自NEB公司。通過上述方法鑑定的質粒命名為pG7X。
7.質粒pG7X序列測定3018鹼基對的質粒pG7X的測序結果見圖4，其多克隆位點的序列見圖5。
本發明構建的質粒pG7X具有如下特點1)pG7X保留了pGEM7Zf(+)的氨苄青黴素抗性基因，便於用氨苄青黴素對重組體進行篩選(見圖1)。
2)pG7X保留了pGEM7Zf(+)的高拷貝特性(見圖1)，有利於從大腸桿菌中提取大量質粒DNA。
3)pG7X大小僅為3018鹼基對(見圖4)，比較小，便於進行DNA操作。
4)pG7X的多克隆位點兩側有T7、SP6、M13通用序列(見圖4)，因此，對在多克隆位點插入的外源DNA進行序列測定有廣泛的通用引物供選擇。
5)pG7X的lacZ基因長度雖增加到384鹼基對，但讀碼框架沒有改變(見圖4)，不改變應用5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷對重組體進行藍白斑篩選的特性。
6)pG7X保留了pGEM7Zf(+)多克隆位點的大部分酶切識別序列，便於與多種限制性內切酶酶切片段實現連接。與pGEM7Zf(+)相比，少了SmaI位點，多了2個XcmI位點(見圖5)。
7)pG7X保留了pGEM7Zf(+)的T7、SP6啟動子元件，且這些元件位於多克隆位點兩側(見圖1)，因此可正反兩方向體外轉錄目的基因。
8)XcmI是一稀有限制性內切酶，其識別序列為CCANNNNN*NNNNTGGG，中間9個核苷酸對XcmI的酶切特異性及酶切效率沒有影響。pG7X在pGEM7Zf(+)多克隆位點裡插入了2個XcmI識別序列，因此可方便地用XcmI酶切以獲取兩端都是3′dT粘性末端的DNA片段(見圖6)，所以，可方便地獲得穩定的T載體。
用XcmI酶切質粒pG7X製備的T載體，命名為pG7X-T，其製備方法如下用XcmI酶切pG7X質粒，0.7％瓊脂糖凝膠電泳回收大片段，即為T載體，命名為pG7X-T(圖6)。酶切體系參照步驟6，但體積增大到50微升。
T載體pG7X-T的使用方法如下將製備的T載體pG7X-T與帶有dA尾的DNA片段按摩爾比1∶3混合，加入T4 DNA連接酶，於12℃連接；用標準的氯化鈣處理法將連接物轉化進感受態細胞E.coli DH5α，然後塗於含50微克/毫升氨苄青黴素，表面均勻地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩爾/升的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培養16小時，白色菌落含有由pG7X-T與插入DNA形成的重組質粒。
載體pG7X-T可以在分子生物學技術、基因晶片技術、生物工程和醫學等領域中廣泛應用。
本發明的有益效果是利用本發明製備T載體的成本在60元/微克以下，僅為市場價格的十分之一，而且操作簡便、性能穩定、重組率高，既適合研究室內自製，也可應用於商業生產。
下面結合附圖與具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述。


圖1質粒pGEM7Zf(+)圖譜圖2 pGEM7Zf(+)的PCR擴增圖3左圖為質粒pG7X的SmaI酶切結果，右圖為pG7X的XcmI酶切結果。
圖4質粒pG7X的全長序列圖5質粒pG7X多克隆位點的DNA序列圖6利用pG7X產生T載體示意圖
具體實施例方式
實施例一T載體pG7X-T的製備1.質粒pGEM7Zf(+)的PCR擴增及HindIII酶切根據pGEM7Zf(+)序列(圖1)設計一對引物pG7X-F2和pG7X-R2，引物的5′端分別插入HindIII(單線處)和XcmI(波線處)識別位點。引物序列為pG7X-F2gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctcccapG7X-R2gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt以質粒pGEM7Zf(+)DNA為模板，pG7X-F2和pG7X-R2為引物，在大連寶生物有限公司的Ex Taq DNA聚合酶作用下進行擴增反應。20微升擴增體系中，含6皮摩爾的pG7X-F2，6皮摩爾的pG7X-R2，5納克的pGEM7Zf(+)，0.5單位的Ex TaqDNA聚合酶，2.0微升的Ex-緩衝液，1.6微升的dNTPs(每種dNTP的濃度為2.5毫摩爾/升)；反應循環為94℃下預熱5分鐘後，經35個反應循環(94℃ 40秒，60℃ 32秒，72℃ 200秒)，然後在72℃下保溫7分鐘，最後保存在4℃。大約3千鹼基對的擴增產物(圖2)經0.7％瓊脂糖凝膠電泳純化回收後，置於37℃進行HindIII酶切。酶切體系為2.8微克的PCR產物，23微升的緩衝液，120單位的HindIII，補水至230微升。酶切產物通過0.7％瓊脂糖凝膠電泳回收大片段DNA。
2.HindIII酶切產物的環化回收的DNA酶切片段加入到含T4 DNA連接酶的溶液中，12℃保溫過夜，進行連接，實現自身環化。10微升連接體系為240納克的DNA片段，1微升的緩衝液，350單位的T4DNA連接酶。
3.連接DNA轉化大腸桿菌用標準的氯化鈣處理法製備E.coli DH5α感受態細胞，將連接物轉化進感受態細胞E.coliDH5α，然後塗於含50微克/毫升氨苄青黴素，表面均勻地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩爾/升的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培養16小時後，選取藍色菌落。
4.菌落的PCR篩選隨機挑選一定數目的藍色菌落，以pG7X-F2/pG7X-R2為引物進行菌落PCR。15微升擴增體系中，含4.5皮摩爾的pG7X-F2，4.5皮摩爾的pG7X-R2，0.5單位的rTaq DNA聚合酶，1.5微升的rTaq-緩衝液、1.2微升的dNTPs(每種dNTP的濃度為2.5毫摩爾/升)。反應循環為94℃預熱10分鐘後，經35個反應循環(94℃ 40秒，60℃ 32秒，72℃ 200秒)，然後在72℃下保溫7分鐘，最後保存在4℃，通過瓊脂糖電泳篩選含有3千鹼基對擴增產物的陽性菌落。
5.陽性菌的進一步篩選和鑑定將上一步篩選得到的陽性菌分別劃線挑選單菌落，接種於10毫升含50微克/毫升氨苄青黴素的液體LB培養基中過夜培養，用標準的鹼裂解法提取其質粒DNA，0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測。然後對質粒DNA進行PCR鑑定，方法同步驟4。
6.用限制性內切酶SmaI和XcmI酶切鑑定上一步提取的質粒DNA進行酶切和瓊脂糖凝膠電泳，應產生3千鹼基對DNA片段，見圖3M為DNA分子量標準物λ-EcoT14I digest，1、2、3及4為不同的克隆。酶切體系(1)5單位的SmaI酶，1微升的牛血清白蛋白，1微升的緩衝液T，200納克的DNA，補水至10微升，30℃酶切過夜；(2)2.5單位的XcmI酶、1微升的緩衝液N，200納克的DNA，補水至10微升，37℃酶切過夜。SmaI購自大連寶生物公司，XcmI購自NEB公司。通過上述方法鑑定的質粒命名為pG7X。
7.質粒pG7X序列測定3018鹼基對的質粒pG7X的測序結果見圖4，其多克隆位點的序列見圖5。
8.XcmI酶切製備T載體用XcmI酶切pG7X質粒，0.7％瓊脂糖凝膠電泳回收大片段，即為T載體，命名為pG7X-T。見圖6。酶切體系參照步驟6，但體積增大到50微升。
實施例二T載體pG7X-T的性能檢驗將製備的T載體pG7X-T與帶有dA尾的插入DNA(Control Insert DNA，購自大連寶生物公司)按1∶3的摩爾比混合，加入T4 DNA連接酶，於12℃連接。用標準的氯化鈣處理法將連接物轉化進感受態細胞E.coli DH5α，然後塗於含50微克/毫升氨苄青黴素，表面均勻地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩爾/升的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培養16小時，白色菌落含有由pG7X與插入DNA形成的重組質粒，藍色菌落中的質粒不含有插入DNA。統計菌落數，計算白斑率。實驗結果表明，白斑率平均為94.4％。
實施例三T載體pG7X-T的應用用實施例二中篩選到的、白斑率最高的陽性菌株提取質粒DNA，用限制性內切酶XcmI酶切，通過0.7％瓊脂糖凝膠電泳回收大片段，即為所需T載體pG7X-T。T載體pG7X-T與PCR擴增的穀胱甘肽巰基轉移酶Zeta類基因——AtGSTZ基因DNA(Chen D F，Kawarasaki Y，Nakano H，et al.JBiosci Bioeng，2003，95594-600)，按1∶3的摩爾比混合，加入T4 DNA連接酶，進行連接反應，連接物轉化進E.coli DH5α，統計菌落數，計算白斑率，白斑率平均為88.8％。對白色菌落進行菌落PCR鑑定，檢查是否插入了AtGSTZ基因，實驗結果表明，陽性重組率為95.6％。
SEQUENCE LISTING110南開大學120用於T-A克隆的pG7X-T載體及其製備方法1300410251603170PatentIn version 3.121012112989212DNA213人工序列220
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權利要求
1.用於T-A克隆的pG7X-T載體及其製備方法，其特徵在於，該載體DNA序列如下0001 GACTGGGGA TCCGGAGAGC TCCCAACGCG TTGGATGCAT AGCTTGAGTA TTCTATAGTG TCACCTAAAT AGCTTGGCGT AATCATGGTCTCTGACCCCT AGGCCTCTCG AGGGTTGCGC AACCTACGTA TCGAACTCAT AAGATATCAC AGTGGATTTA TCGAACCGCA TTAGTACCAG0091 ATAGCTGTTT CCTGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG TGTAAAGCCT GGGGTGCCTATATCGACAAA GGACACACTT TAACAATAGG CGAGTGTTAA GGTGTGTTGT ATGCTCGGCC TTCGTATTTC ACATTTCGGA CCCCACGGAT0181 ATGAGTGAGC TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC CAGCTGCATT AATGAATCGGTACTCACTCG ATTGAGTGTA ATTAACGCAA CGCGAGTGAC GGGCGAAAGG TCAGCCCTTT GGACAGCACG GTCGACGTAA TTACTTAGCC0271 CCAACGCGCG GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCGGGTTGCGCGC CCCTCTCCGC CAAACGCATA ACCCGCGAGA AGGCGAAGGA GCGAGTGACT GAGCGACGCG AGCCAGCAAG CCGACGCCGC0361 AGCGGTATCA GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCATCGCCATAGT CGAGTGAGTT TCCGCCATTA TGCCAATAGG 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2.根據權利要求1所述的用於T-A克隆的pG7X-T載體及其製備方法，其特徵在於，根據質粒pGEM7Zf(+)的序列，設計了一對PCR引物——pG7X-F2和pG7X-R2，其序列如下pG7X-F2gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctcccapG7X-R2gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt
3.根據權利要求2所述的用於T-A克隆的pG7X-T載體及其製備方法，其特徵在於，兩條引物的5′-端分別插入限制性內切酶HindIII和XcmI識別位點，其位點分別用單線和波線標示如下pG7X-F2gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctcccapG7X-R2gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt
4.根據權利要求1所述的用於T-A克隆的pG7X-T載體及其製備方法，其特徵在於，以pGEM7Zf(+)DNA為模板、pG7X-F2和pG7X-R2為引物構建的新質粒，命名為pG7X，其步驟和方法如下1)質粒pGEM7Zf(+)的PCR擴增及HindIII酶切2)HindIII酶切產物的環化3)連接DNA轉化大腸桿菌4)菌落的PCR篩選5)陽性菌的進一步篩選和鑑定6)用限制性內切酶SmaI和XcmI酶切鑑定7)質粒pG7X序列測定
5.根據權利要求1所述的用於T-A克隆的pG7X-T載體及其製備方法，其特徵在於，用XcmI酶切質粒pG7X製備的T載體，命名為pG7X-T，其製備方法如下12.5單位的XcmI酶、5微升的緩衝液N，1微克的pG7X DNA，補水至50微升，37℃酶切過夜後0.7％瓊脂糖凝膠電泳回收大片段。
6.根據權利要求5所述的用於T-A克隆的pG7X-T載體及其製備方法，其特徵在於，T載體pG7X-T的使用方法如下將製備的T載體pG7X-T與帶有dA尾的DNA片段按摩爾比1∶3混合，加入T4DNA連接酶，於12℃連接；用標準的氯化鈣處理法將連接物轉化進感受態細胞E.coli DH5α，然後塗於含50微克/毫升氨苄青黴素，表面均勻地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩爾/升的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培養16小時，白色菌落含有由pG7X-T與插入DNA形成的重組質粒。
7.根據權利要求5所述的用於T-A克隆的pG7X-T載體及其製備方法，其特徵在於，T載體pG7X-T在分子生物學技術、基因晶片技術、生物工程和醫學領域的應用。
全文摘要
本發明涉及用於T－A克隆的pG7X－T載體及其製備方法，屬於重組DNA技術的載體構建領域，其技術方案是利用自行設計的引物對質粒pGEM7Zf(+)進行擴增，擴增產物經HindIII消化、自連、轉化、篩選等過程，獲得新質粒pG7X。相比pGEM7Zf(+)而言，pG7X增加了2個XcmI識別位點，可用於製備T－A克隆載體。用XcmI酶切後得到的兩端帶有3′dT粘性末端的DNA即為T載體，命名為pG7X－T。該T載體與帶有dA末端DNA片段或PCR產物進行連接，陽性重組率達95％以上。利用本發明製備T載體的成本在60元/微克以下，僅為市場價格的十分之一，而且操作簡便、性能穩定、重組率高。
文檔編號C12N15/70GK1614018SQ20041007238
公開日2005年5月11日 申請日期2004年10月26日 優先權日2004年10月26日
發明者陳德富, 楊鵬, 陳喜文 申請人:南開大學