來自半片藻屬的脂肪酸脫飽和酶的利用的製作方法
2023-05-28 17:21:06
來自半片藻屬的脂肪酸脫飽和酶的利用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及與脫飽和酶有關的方法和組合物，所述脫飽和酶調節長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)中雙鍵的數量和位置。特別地，本發明涉及利用外源的脫飽和酶和編碼這樣的酶的核酸，來改善植物產品和部分中ω-3脂肪酸分布的方法和組合物。在特定的實施方式中，利用的外源脫飽和酶是半片藻屬物種Δ5脫飽和酶。還提供的是改善的大豆油組合物，其具有衍生自帶有感興趣基因的植物的EPA。
【專利說明】來自半片藻屬的脂肪酸脫飽和酶的利用
[0001] 本申請是申請日為2009年10月14日和發明名稱為「來自半片藻屬的脂肪酸脫飽和酶的利用」的200980140691.2號發明專利申請的分案申請。
_2] 對相關申請的引用
[0003]本申請要求2008年10月14日提交的美國臨時申請N0.61 / 105，316的優先權，通過引用將其完全合併在本文中。
[0004]序列表的引入
[0005]作為當前的公開的一部分的序列表包括標題為「M0NS219W0_ST25.txt」的36KB計算機可讀文件，其包含通過EFS-Web提交的本發明的核苷酸和/或胺基酸序列。序列表的內容通過完全引用合併在本文中。
[0006]發明背景
[0007]1.發明領域
[0008]本發明一般地涉及脫飽和酶，其調節長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)中雙鍵的數量和位置。特別地， 本發明涉及利用△ 5脫飽和酶和編碼這樣的脫飽和酶的核酸來改變脂肪酸分布。
[0009]2.相關技術的說明
[0010]在大多數生物體中脂肪酸生物合成的主要產物是16-碳和18-碳化合物。這些脂肪酸的鏈長度與不飽和度的相對比例在物種之中廣泛地變化。例如,哺乳動物主要產生飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，而大多數高等植物生產具有一個、兩個或三個雙鍵的脂肪酸，後兩者包括多不飽和脂肪酸(PUFA)。
[0011]兩種主要的PUFA家族是ω-3脂肪酸(也稱為「n-3」脂肪酸)，例子是二十碳五烯酸(EPA，20: 5，n-3)，以及ω-6脂肪酸(也稱為「n-6」脂肪酸)，例子是花生四烯酸(ARA，20: 4，n-6)。PUFA是細胞的質膜和脂肪組織的主要成分，在其中它們可以分別以磷脂和甘油三酯的形式存在。PUFA是哺乳動物中適當的發育所必需的，特別是在嬰兒腦部的發育中，以及對於組織形成和修復是必需的。花生四烯酸是類花生酸類物質的合成的主要前體，類花生酸類物質包括白細胞三烯、前列腺素和凝血噁烷，其也在炎症過程中起到重要作用。
[0012]幾種失調響應於脂肪酸的治療。補充PUFA已經顯示了降低血管成形術後再狹窄的機率。證據表明，PUFA可能涉及鈣代謝，表明PUFA可能在骨質疏鬆症的治療或預防以及腎臟或泌尿道結石的治療或預防中是有用的。健康效益的大部分證據適用於長鏈ω-3脂肪、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸(DHA，22: 6，n-3)，它們在魚類和魚油中存在。
[0013]PUFA，例如，亞油酸(LA，18: 2，Λ 9，12)和 α -亞麻酸(ALA，18: 3, Δ9,12,15)被認為是膳食中的必需脂肪酸，因為哺乳動物缺乏合成這些酸的能力。LA通過Λ12-脫飽和酶從油酸(0Α，18: 1，Λ 9)產生，而ALA通過Λ 15-脫飽和酶從LA產生。然而，當攝食時，哺乳動物具有代謝LA和ALA以形成長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的η_6和η_3家族的能力。在哺乳動物中，LC-PUFA的形成由Λ 6脫飽和的步驟限速，這個步驟將LA轉化成GLA,將ALA轉化成SDA。許多生理學和病理學的狀況已經顯示了甚至進一步地降低這種代謝步驟，因而，降低LC-PUFA的產生。為了克服限速步驟和提高EPA的組織水平，人們可以消費大量的ALA。作為選擇，通過飲食補充EPA或DHA來繞過Λ 6-脫飽和可以有效地減輕許多與低水平的PUFA相關的病理性疾病。然而，如以下更詳細地闡述的，PUFA的當前可用的來源不是理想的。
[0014]主要的重要長鏈PUFA包括DHA和ΕΡΑ，其主要在不同類型的魚油中存在，以及ARA，其在絲狀真菌例如被孢黴屬(Mortierella)中發現。對於DHA，存在著商業生產的許多來源，包括多種海洋生物、從冷水海洋魚類獲得的油、以及蛋黃級分。然而，從天然來源商業生產PUFA存在幾個缺點。PUFA的天然來源傾向於具有高度異質的油組成。因而從這些來源獲得的油可能需要大量的純化來分離出一種或多種期望的PUFA，或來產生富集了一種或多種PUFA的油。
[0015]其他天然的限制也希望獲得生產PUFA的新方法。天氣和疾病可以導致來自魚類和其他海洋來源的產量的變動。生物體例如被孢黴屬的大規模的發酵是昂貴的。天然的動物組織含有很低數量的ARA，並且難以被加工。
[0016]發明概沭
[0017]本發明的一個方面提供了編碼多肽的分離的核酸，所述多肽能夠在碳5使脂肪酸分子脫飽和。這些核酸可以用於轉化細胞或修飾植物的脂肪酸組成或植物產生的油。本發明的某些實施方式提供了分離自具有獨特的脫飽和酶活性的半片藻屬物種(Hemiselmisspp.)的分離的多核苷酸序列。在本發明的某些進一步的實施方式中，所述多核苷酸編碼與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽序列具有至少75%的序列同一性、包括與這些序列具有至少約80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、98%和99%同一性的多肽。本領域技術人員將認識到，由於這些序列是相關的，給定的序列可能同時與這些多肽序列的超過一種享有75%或更高的序列同一性。在某些實施方式中，本發明的半片藻屬物種的脫飽和酶進一步被限定為ω-3 Λ 5脫飽和酶(即，具有ω-3底物偏愛的脫飽和酶)。
[0018]在另一個方面，本發明提供了編`碼多肽的分離的多核苷酸，所述多肽具有在碳5使脂肪酸分子脫飽和的脫飽和酶活性，`所述多核苷酸包含選自以下的序列:(a)編碼SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的多肽的多核苷酸；(b)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列的多核苷酸；(c)在5XSSC、50%甲醯胺和42°C的條件下與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或其互補物雜交的多核苷酸；(d)編碼與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽序列具有至少75%、85%、95%、98%或99%的序列同一性的多肽的多核苷酸；和e)編碼具有至少一種以下胺基酸基序的多肽的多核苷酸:
【權利要求】
1.一種用多核苷酸分子轉化的轉基因植物或植物部分的細胞，所述多核苷酸分子包含選自以下的核酸序列: a)編碼SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽序列的核酸序列； b)SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列；和 c)編碼與SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽序列具有至少95%的序列同一性、具有在碳5使脂肪酸分子脫飽和的脫飽和酶活性的多肽的核酸序列， 其中所述多核苷酸分子與異源啟動子可操作地連接。
2.權利要求1的轉基因植物或植物部分的細胞，所述植物選自芥花、菜苔、含油種子油菜、油菜籽、大豆、海甘藍、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花、油棕、亞麻、葵花、玉米、水稻、大麥、粟、黑麥、小麥、燕麥、苜蓿和高粱。
3.權利要求1的轉基因植物或植物部分的細胞，進一步包含編碼脂肪酸脫飽和酶或延伸酶的至少一種另外的多核苷酸。
4.權利要求3的轉基因植物或植物部分的細胞，進一步包含編碼Λ6脫飽和酶、Λ 6延伸酶、Λ 18延伸酶、Λ 15脫飽和酶、Δ 9延伸酶、Λ 8脫飽和酶、Δ 17脫飽和酶、Λ 4脫飽和酶或C20延伸酶的多核苷酸。
5.權利要求1的轉基因植物的子代植物的細胞，其中所述子代植物包含所述多核苷酸分子。
6.從權利要求1的植物或植物部分獲得的商業產品，其中所述產品包含所述多核苷酸分子或由所述多核苷酸分子編碼的多肽，其中所述商業產品是食物或飼料。
7.權利要求6的商業產品,其中所述食物或飼料是油、青忙飼料、粗粉、穀粒、澱粉、細粉或蛋白質。
8.權利要求6的商業產品，其中所述商業產品包含EPA、ARA和/或DHA。
9.一種生產食物或飼料組合物的方法，包括步驟: (a)獲得根據權利要求1的轉基因植物或植物部分；和 (b)生產所述食物或飼料組合物。
10.權利要求9的方法，其中所述食物或飼料是油、青貯飼料、粗粉、穀粒、澱粉、細粉或蛋白質。
【文檔編號】C12N5/10GK103756972SQ201410049582
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2009年10月14日 優先權日:2008年10月14日
【發明者】V·厄辛, B·弗羅曼, S·斯克瑞恩, L·勒曼 申請人:孟山都技術公司