一種快速篩選高產乙醇酵母菌的方法
2023-05-29 04:17:16 1
一種快速篩選高產乙醇酵母菌的方法
【專利摘要】一種快速篩選高產乙醇酵母菌的方法，首先繪製菌株的生長曲線，據此判斷其延遲期、對數生長期、穩定期；配製並分裝若干試管液體培養基，其中一半倒置放入裝滿液體培養基的發酵小管，將兩種試管培養基高壓蒸汽滅菌，取出冷卻；在未放發酵小管的試管液體培養基中接入菌種，振蕩培養至對數生長末期，取出待用；在菌液培養期間，配製抗生素母液，過濾除菌；無菌操作將發酵小管從試管液體培養基中取出，倒置放入上述培養至對數生長末期的培養液中，保證小管內無氣泡進入，並加入適量抗生素溶液，將其轉而進行靜止發酵培養；待培養至一個周期後，取出上述試管液體，觀察發酵小管內氣柱大小，氣柱越大，乙醇產量越高，從而能夠快速篩選出目的菌株。
【專利說明】一種快速篩選高產乙醇酵母菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物學【技術領域】，涉及快速初步篩選微生物高產菌株，特別是在無氧條件下能利用葡萄糖高產乙醇的微生物的快速篩選方法。
【背景技術】
[0002]菌種篩選一直是微生物學領域的重要研究內容之一，也是相關科研工作中需要重點解決的難點之一。對於微生物的定向篩選如定向誘變而言，其目的突變株的篩選工作複雜而重要，而如果沒有篩選標記，目的菌株的篩選將更加盲目、繁重。關於目的菌株的篩選方法，國內外的科研工作者做了大量研究探討，也提出了許多不同思路。這些思路減輕了一些研究任務，目的和方向性也更明確，但仍然工作量巨大。因此有必要對目的菌株的篩選方法做進一步探討。
[0003]另一方面，當能源危機迫使人類開發利用新能源時，篩選高產乙醇的酵母菌菌種就成為轉化纖維素或半纖維素生成乙醇的關鍵影響因素之一。
[0004]對於酵母菌，其利用葡萄糖的代謝機理如下:
在以葡萄糖為碳源的培養基(如YEro培養基)或可轉化為葡萄糖的培養基(如PDA培養基)中，酵母菌如釀酒酵母在有氧和無氧條件下都能利用葡萄糖進行代謝。當環境中有氧時，酵母菌能將部分葡萄糖徹底氧化獲得生長繁殖所需要的能量，同時產生CO2 ;當環境中無氧時，酵母菌也能夠發酵葡萄糖，進行低效率的產能代謝，同時生成乙醇和co2。
[0005]有氧時:
【權利要求】
1.一種快速篩選高產乙醇酵母菌的方法，其特徵在於:該方法的步驟是: 第I步、首先繪製菌株的生長曲線，據此判斷其延遲期、對數生長期、穩定期； 第2步、配製並分裝若干試管液體培養基，其中一半倒置放入裝滿液體培養基的發酵小管，將兩種試管培養基高壓蒸汽滅菌，取出冷卻； 第3步、在未放發酵小管的試管液體培養基中接入菌種，振蕩培養恰好至對數生長末期，取出待用； 第4步、在菌液培養期間，配製抗生素母液，過濾除菌； 第5步、無菌操作將第2步中的發酵小管從試管液體培養基中取出，倒置放入上述第3步培養至對數生長末期的培養液中，保證小管內無氣泡進入，並加入適量第4步配製的抗生素溶液，將其轉而進行靜止發酵培養； 第6步、待培養至一個周期後，取出上述第5步中的試管液體，觀察發酵小管內氣柱大小，氣柱越大，乙醇產量越高，從而能夠快速篩選出目的菌株。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於該方法具體操作如下: (1)酵母菌生長曲線的繪製 在前期試驗中已確定的、包括培養基成分及含量、培養溫度、pH、培養周期、振蕩速率在內的最佳培養條件下，接種酵母菌於液體培養基中並培養，以培養時間為橫坐標、以菌液的吸光度值A6tltl為縱坐標，繪製酵母菌培養液的吸光度值A6tltl隨培養時間變化的生長曲線，據此判斷菌株生長的延遲期、對數生長期、穩定期； (2)試管液體培養基配製及滅菌 配製含葡萄糖的培養基YEH)或可轉化成葡萄糖的培養基PDA或豆芽汁葡萄糖培養基或麥芽汁葡萄糖培養基lOOOmL，分裝成100個試管液體，每個9.5nT9.8mL,取其中的50個試管液體，向其中倒置放入充滿上述液體培養基0.2mL^0.5mL的發酵小管，小心操作以免小管內進入氣泡，將裝有發酵小管的試管液體培養基，記為a，和另外50個未裝發酵小管的試管液體培養基，記為b,同時在112°C、0.5Mpa溼熱蒸汽下滅菌20min,取出冷卻至室溫； (3)接種與培養 以0.5%的接種量在未裝發酵小管的試管液體培養基b中接入酵母菌菌株，在30°C下`150 r/min振蕩培養恰好至對數生長期末期，取出待用，記為c ； (4)抗生素母液配製 分別配製卡那黴素溶液母液和氯黴素溶液母液，濃度均為0.5g/100mL，兩種抗生素母液分別在無菌操作下過濾除菌；抗生素母液的配製在接種後菌液培養時期進行； (5)乙醇發酵 在無菌操作下，將a中的發酵小管從試管液體中取出，迅速倒置放入培養至對數生長期末期的培養液c中，小心操作以使發酵小管中不進入氣泡，然後迅速向同一培養液中分別加入終濃度為50 μ g/mL的卡那黴素溶液和終濃度為25 μ g/mL的氯黴素溶液，以上操作完成後，將裝有發酵小管的試管培養液c繼續在30°C下靜置培養至一個培養周期； 一個培養周期包括不產乙醇的菌體生長階段和菌體發酵葡萄糖產乙醇和CO2階段； (6)乙醇高產菌株的初篩 將上述完成一個培養周期的培養液c取出，觀察試管液體中發酵小管內的氣泡產生情況及排出液體情況，根據發酵小管內氣柱大小即能初步判斷出酵母菌產乙醇的多少，氣柱越大，間接說明乙醇產量越高，這樣能夠很迅速地篩選出高產乙醇的目的菌株；產乙醇的多少通過進一步定量檢測來確定。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於該方法還包括: (7)初篩結果驗證 將上述初篩得到的高產菌株進行產乙醇發酵，然後取樣，適當稀釋，運用生物傳感分析儀法或液相色譜法進行產乙醇分析，以驗證本方法初篩結果的準確性。
【文檔編號】C12Q1/04GK103789396SQ201310324826
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年7月30日 優先權日:2013年7月30日
【發明者】吳新世, 董曉惠, 李羚, 孫景峰 申請人:天津理工大學