基於類石墨相碳化氮納米材料的螢光傳感器的製備方法
2023-06-10 14:32:41 1
基於類石墨相碳化氮納米材料的螢光傳感器的製備方法
【專利摘要】本發明提供了一種基於類石墨相碳化氮納米材料的螢光傳感器的製備方法，將類石墨相碳化氮納米材料，結合酶切循環信號放大技術，製成螢光傳感器。該螢光傳感器包括類石墨相碳化氮納米片（g-C3N4-NF），Ag+，Nb.BsmI切刻內切酶，探針基因、靶標基因（Cerb B-2相關基因短片段）。該螢光傳感器經雜交、酶切水解、再雜交的循環過程，使得一條靶標基因即可釋放出多個髮夾結構探針基因上的Ag+，使得溶液中游離的Ag+量增多，導致碳化氮的螢光猝滅程度增強，螢光信號明顯減弱。通過這種多次循環信號放大的技術，可實現對靶標基因的高靈敏度檢測。
【專利說明】基於類石墨相碳化氮納米材料的螢光傳感器的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於螢光傳感器的製備領域，具體涉及一種基於類石墨相碳化氮納米材料的螢光傳感器的製備方法。
【背景技術】
[0002]乳腺癌是全世界女性發病率最高的惡性腫瘤之一。早期診斷是提高乳腺癌治癒率的關鍵。到目前為止，乳腺癌診斷的基本方法主要有乳腺鉬靶、乳腺B超、動態增強核磁共振等。然而以上檢查方法或容易造成漏診；或操作繁瑣、耗時、設備昂貴，難以推廣應用於大規模的乳腺癌普查。而作為乳腺癌診斷的金標準一基於穿刺活檢的病理組織學診斷法具有創傷性，不僅使病人身體疼痛，還會引起病人因長時間等待檢測報告所產生的焦慮和恐懼。因此，研宄一種更準確、靈敏、經濟、簡便、更人性化的無創檢測新技術，並將其用於臨床乳腺癌的早期診斷無疑具有重要的意義。腫瘤標誌物在正常組織或良性疾病中不產生或產生的量極少。
[0003]在腫瘤發生的早期，當其他檢查還未發現時，血液中腫瘤標誌物已有不同程度的升高，因此，具有無創特點的腫瘤標誌物檢測技術是目前有效的早期發現無症狀腫瘤的方法。人類表皮生長因子受體2 (Cerb B-2)是一種常見的乳腺癌腫瘤標記物，它是一種原癌基因，又稱HER-2或neu，它是表皮生長因子家族中主要成員，其蛋白產物具有酪氨酸激酶活性，能夠啟動自身磷酸化過程，可促使乳腺腫瘤細胞向惡性轉化，研宄表明，Cerb B-2基因的檢測在乳腺癌的確診分期、監測和判斷預後中起著重要的作用。可是一般在乳腺癌的早期，Cerb B-2基因的濃度在實際樣本中一般較低，直接進行檢測的效果差，所以近年來，應用信號放大檢測技術來提高檢測靈敏度受到越來越多的關注。早期的信號放大是利用聚合酶鏈反應技術(PCR)，此項技術從1985年問世以來被廣泛的應用在臨床試驗中，可是具有易造成假陽性、易被汙染等缺點。滾環擴增技術(RCA)和生物條碼技術是近年來發展的通過放大信號來檢測DNA的新方法，它們雖然大大的提高了檢測的靈敏度，但是仍然存在操作過程複雜、費用高等缺點。因此，我們需要尋找一種簡便、準確、靈敏的方法來檢測實際樣本中的Cerb B-2基因。
[0004]近年來，利用切刻內切酶輔助信號放大的方法用在DNA的檢測引起越來越多的學者關注。切刻內切酶是一種特殊的限制性核酸內切酶，它能夠識別雙鏈DNA中的特異核酸序列，只切割其中的一條DNA鏈。這類酶被發現後，引起了科研工作者們的廣泛關注，近年來，已有一些學者利用切刻內切酶輔助信號放大技術用於DNA的檢測，雖然這種技術有效的提高了檢測的靈敏度，但是由於這些方法需要使用分子信標技術，因此存在操作複雜、價格昂貴等缺點。因此，在此基礎上有必要繼續研宄一種既簡便又經濟的生物傳感新方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種基於類石墨相碳化氮納米材料的螢光傳感器的製備方法。本發明利用類石墨相碳化氮納米片在Ag+、DNA探針和目標序列存在下的螢光「關-開-關」的性質，可以實現DNA的靈敏特異性檢測，檢測限低，經濟、簡便、實用。
[0006]為實現上述目的，本發明採用如下技術方案:
基於類石墨相碳化氮納米材料的螢光傳感器的製備方法，包括以下步驟:
(1)將50UL I μ M探針基因與10 UL 10 mM的Ag+溶液混合，用Tris-HNO 3緩衝液稀釋至100 μ L，混勻並反應Ih;
(2)將混合體系加入到900UL的類石墨相碳化氮納米片混懸液中，混勻，測其螢光強度；
(3)繼續往上述體系中加入含有不同濃度的靶標基因和10U的Nb.BsmI切刻切割酶的混合體系，混勻反應lh，檢測螢光強度的變化，實驗結果見附圖4，由圖可知，一定範圍內，隨著目標DNA濃度增加，髮夾結構的探針基因因雜交繼而酶切作用所釋放出的Ag+量越多，猝滅碳化氮的螢光程度越強，螢光信號越弱；碳化氮的發射波長為396 nm。測定的條件:測定介質為Tris-HNO3緩衝溶液，pH =7.9。
[0007]依據上述方法得到螢光傳感器。
[0008]所述的類石墨相碳化氮納米片的製備方法為:
(1)微波合成類石墨相碳化氮粉末:往微波管中加入2mL甲醯胺，置於微波合成儀中，180-200 °C下反應30 min，得到黑色的類石墨相碳化氮，用雙蒸水洗淨，真空乾燥得類石墨相碳化氮黑色粉末；
(2)納米片的製備:用去離子水溶解類石墨相碳化氮，超聲剝離24h ;將超聲後的液體轉移至離心管中，置於離心機中15000 r/min離心I h，取上清液得到類石墨相碳化氮納米片混懸液。
[0009]步驟(I)中所述的探針基因其序列為5』 -CCCCCCAACTGCATTCCAACAAGTCTCCCCCC-3』(購於上海生工生物工程技術服務有限公司)。
[0010]步驟(3)中所述的靶標基因其序列為5』-AGACTTGTTGGAATGCAGTT-3』(購於上海生工生物工程技術服務有限公司)。
[0011]步驟(I)中所述的Tris-HNO3 緩衝液是由 25 mM Tris,50 mM NaNOjP 15 mM MgNO3配製而成的，並用5 mol/L的HNO3調至pH 7.9。
[0012]所述的製備方法製得的螢光傳感器用於乳腺癌相關基因片段的檢測，螢光分析法測定參數:λεχ=330 nm, λ em=396 nm，激發和發射光狹縫值均為5 nm，PMT檢測電壓為600Vo其線性範圍為:5 fM~0.1 ρΜο回歸方程為F=183.97744 — 1.52594C，線性相關係數r為0.9970，該方法對特定序列DNA的最低檢測下限為0.2 fM。具體檢測方法為:在含有探針基因、Ag+和類石墨相碳化氮納米片的混合體系中加入含有一定濃度的互補或單鹼基錯配或不互補DNA和10 U Nb.BsmI切刻內切酶的混合液，進行雜交反應；上述反應液用螢光分析法檢測。
[0013]本發明採用微波合成法製備類石墨相碳化氮納米材料，並結合酶切循環信號放大技術製成螢光傳感器，用於乳腺癌Cerb B-2相關基因片段的檢測。其具體機理為:Ag+可與類石墨相碳化氮納米片結合併使其螢光猝滅，即螢光處於「關」的狀態。探針基因加入後，Ag+與探針基因上的胞啼啶共價結合形成更穩定的C- Ag+-C錯配結構，導致Ag+與類石墨相碳化氮納米片的結合量減少，螢光猝滅程度低，即螢光處於「開」的狀態。當再加入互補靶標基因時，其與探針基因雜交形成雙鏈DNA，經過Nb.BsmI切刻內切酶切割循環，髮夾結構探針基因上的Ag+完全釋放出來，使得Ag +與類石墨相碳化氮納米片的結合量增加，螢光猝滅程度高，即螢光處於「關」的狀態，從而成功實現酶切循環信號放大技術的螢光生物傳感器的研製。通過這種循環信號放大的技術，可實現對Cerb B-2相關基因的高靈敏度檢測，並有望推廣應用於其他類型腫瘤的早期診斷及篩選抗腫瘤新藥工作中，因而本發明具有巨大的潛在應用價值和深遠的意義。
[0014]本發明的有益效果在於:
1)本發明採用微波合成法製得的類石墨相碳化氮納米材料具有較高的水溶性和較強的螢光信號，用於螢光傳感器中能增強螢光信號；
2)利用類石墨相碳化氮納米片在Ag+、DNA探針和目標序列存在下的螢光「關-開-關」的性質，可以實現DNA的靈敏特異性檢測；
3)在最佳條件下，該螢光傳感器的線性範圍為5fM~0.1 pM，檢測限達到0.2 fM，且具有良好的選擇性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1是類石墨相碳化氮納米材料的原子力顯微鏡圖；
圖2是類石墨相碳化氮納米材料的傅立葉變換紅外光譜(FTIR)圖；
圖3為加入Ag+或不同的DNA雜交後類石墨相碳化氮螢光信號的變化，圖中:(a)碳化氮的焚光信號，Cd)碳化氮中加入Ag+的焚光信號，(b)碳化氮中加入Ag + 和探針DNA後的焚光信號，(c)碳化氮中加入Ag+和探針DNA後再加入互補革E標DNA的焚光信號；
圖4為本發明的螢光信號檢測圖。
【具體實施方式】
[0016]本發明用下列實施例來進一步說明本發明，但本發明的保護範圍並不限於下列實施例。
[0017]本發明的螢光傳感器包括類石墨相碳化氮納米片(g-C3N4_NF)，Ag+，Nb.BsmI切刻內切酶，探針基因。在探針基因溶液中加入Ag+，Ag+與探針基因上的胞嘧啶共價結合形成更穩定的C-Ag+-C錯配結構，使得探針基因回折形成髮夾結構。繼續加入類石墨相碳化氮納米片混懸液，由於溶液中游離的Ag+減少甚至幾乎為零，導致Ag+與碳化氮的結合量減少，所以碳化氮的螢光猝滅程度低，螢光信號較強。當互補靶標基因存在時，其與探針基因雜交形成雙鏈DNA，導致探針基因的髮夾結構打開並釋放出Ag+。同時，雜交所形成的DNA雙鏈可產生Nb.BsmI切刻內切酶的酶切位點，Nb.BsmI切刻內切酶切割雙鏈中含有特殊序列的探針基因鏈，使得探針基因被酶水解，靶標基因被釋放出來並可繼續與下一個探針基因雜交。由此所形成的雜交、酶切水解、再雜交的循環過程，使得一條靶標基因即可釋放出多個髮夾結構探針基因上的Ag+，使得溶液中游離的Ag+量增多，導致碳化氮的螢光猝滅程度增強，螢光信號明顯減弱。通過這種多次循環信號放大的技術，可實現對靶標基因的高靈敏度檢測。
[0018]實施例1
I)類石墨相碳化氮納米片的製備:往微波管中加入2 mL甲醯胺，置於微波合成儀中，190 °C下反應30 min，得到黑色的類石墨相碳化氮，用雙蒸水洗淨，真空乾燥即得類石墨相碳化氮黑色粉末。用去離子水溶解類石墨相碳化氮，超聲剝離24 h;將超聲後的液體轉移至離心管中，置於離心機中15000 r/min離心I h，取上清液即可得到類石墨相碳化氮納米片(g-C3N4-NF)混懸液；
2 )探針基因:5』 -CCCCCCAACTGCATTCCAACAAGTCTCCCCCC-3』 (由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)；靶標基因:5』-AGACTTGTTGGAATGCAGTT-3』為特定序列DNA (由上海生工生物工程技術服務有限公司合成的Cerb B-2相關基因短片段)；將探針基因和靶標基因分別溶於TriS-HNO3緩衝液中製成100 μΜ的探針溶液和100 μΜ的靶標溶液；
3)50 UL I μ M探針基因與10 UL 10 mM的Ag+溶液混合，用Tris-HNO 3緩衝液稀釋至100 μ L，混勻並反應I h。將此混合體系加入到900 μ L的類石墨相碳化氮納米片懸浮液中，混勻，測其螢光強度。繼續往上述體系中加入50 UL I μΜ靶標基因和10 U的Nb.BsmI切刻切割酶的混合液，混勻反應lh，檢測其螢光強度的變化。從實驗結果可知(見附圖3)，當Ag+不存在時，碳化氮的螢光信號較強(a);Ag+存在時，與碳化氮的CNj^合從而使得碳化氮的螢光猝滅，螢光信號明顯減弱(d)。當探針基因加入後，螢光信號增強(b)，這是由於Ag+與探針基因上的胞啼啶共價結合形成更穩定的C- Ag +-C錯配結構，使得Ag+與碳化氮的結合量減少。當互補靶標基因存在時，螢光信號明顯減弱(c)，這是由於靶標基因與探針基因互補雜交形成雙鏈DNA，導致探針基因的髮夾結構打開並釋放出Ag+，使得Ag+與碳化氮的結合量增多；同時，雜交所形成的DNA雙鏈可產生Nb.BsmI切刻內切酶的酶切位點，Nb.BsmI切刻內切酶切割雙鏈中含有特殊序列的探針基因鏈，使得探針基因被酶水解，靶標基因被釋放出來並可繼續與下一個探針基因雜交。
[0019]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。
【權利要求】
1.基於類石墨相碳化氮納米材料的螢光傳感器的製備方法，其特徵在於:包括以下步驟: (1)將50UL I μ M探針基因與10 UL 10 mM的Ag+溶液混合，用Tris-HNO 3緩衝液稀釋至100 μ L，混勻並反應Ih; (2)將混合體系加入到900UL的類石墨相碳化氮納米片混懸液中，混勻，測其螢光強度； (3)繼續往上述體系中加入含有不同濃度的靶標基因和10U的Nb.BsmI切刻切割酶的混合體系，混勻反應lh，檢測螢光強度的變化。
2.根據權利要求1所述的基於類石墨相碳化氮納米材料的螢光傳感器的製備方法，其特徵在於:所述的類石墨相碳化氮納米片的製備方法為: (1)微波合成類石墨相碳化氮粉末:往微波管中加入2mL甲醯胺，置於微波合成儀中，180-200 °C下反應30 min，得到黑色的類石墨相碳化氮，用雙蒸水洗淨，真空乾燥得類石墨相碳化氮黑色粉末； (2)納米片的製備:用去離子水溶解類石墨相碳化氮，超聲剝離24h ;將超聲後的液體轉移至離心管中，置於離心機中15000 r/min離心I h，取上清液得到類石墨相碳化氮納米片混懸液。
3.根據權利要求1所述的基於類石墨相碳化氮納米材料的螢光傳感器的製備方法，其特徵在於:步驟(I)中所述的探針基因其序列為5』 -CCCCCCAACTGCATTCCAACAAGTCTCCCCCC-3，。
4.根據權利要求1所述的基於類石墨相碳化氮納米材料的螢光傳感器的製備方法，其特徵在於:步驟(3)中所述的靶標基因其序列為5』 -AGACTTGTTGGAATGCAGTT-3』。
5.根據權利要求1所述的基於類石墨相碳化氮納米材料的螢光傳感器的製備方法，其特徵在於:步驟(I)中所述的Tris-HNO3緩衝液是由25 mM Tris,50 mM NaNOjP 15 mMMgNO3配製而成的，並用5 mo I/L的HNO 3調至pH 7.9。
6.一種如權利要求1所述的製備方法製得的螢光傳感器的應用，其特徵在於:用於乳腺癌相關基因片段的檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK104480201SQ201410699219
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】陳敬華, 李春豔, 趙燕蘋, 林佳, 劉智晶, 吳冬枝, 蔡淑賢, 羅敏 申請人:福建醫科大學