一種支原體培養鑑定及藥敏檢測板及對C⁺孔結果進行真偽鑑別的方法

2023-06-10 09:27:16

專利名稱：一種支原體培養鑑定及藥敏檢測板及對C+孔結果進行真偽鑑別的方法
技術領域：
本發明所涉及的是臨床醫學檢驗和體外診斷技術領域。具體的是ー種藥敏試驗板，本藥敏試驗板是在普通藥敏試驗板的基礎上，增設了鑑別區，增加額外的鑑別試驗，可在進行支原體藥敏試驗的同時，對C+孔結果進行真偽鑑別。具體鑑別方法是通過在支原體藥敏試驗板的基礎上增加了培養結果性質的鑑別區，鑑別區內包被有非抗支原體類微生物的廣譜抗生素藥物，對陽性對照孔(C+孔)內容易導致假陽性、假陰性的雜菌進行抑制生長或者直接滅活，從而達到對培養結果的鑑別效果，具體包被的藥物可以為β-內醯胺類藥物、磺胺類藥物、利福黴素類、萬古黴素和抗真菌類等藥物中的ー種或幾種。
背景技術：
支原體(mycoplasma)是ー類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物,是ー種不同與細 菌和真菌的另ー類微小病原體，大小一般在O. 3 O. 5um之間，是細胞外生存的最小微生物。從人體分離的16種支原體中，主要有5種對人有致病性，即肺炎支原體(M. pneumoniae,Mp)、解脲支原體(Ureaplasma urealyticum, Uu)、人型支原體(M. homins, Mh)、生埴支原體(M. genitalium,Mg)、穿透支原體(M. penetrans,Mpe)及發酵支原體(M. fermentans,Mf)。其中肺炎支原體(MP)是社區獲得性肺炎的主要病原體，由它引起的肺炎稱為肺炎支原體肺炎，其感染分布於全世界。人類對MP普遍易感，尤其是兒童組為發病高峰。解脲脲原體(UU)、人型支原體(MH)和生殖支原體(MG)等是性傳播疾病的主要病原體，可引起非淋菌性尿道炎、男性前列腺炎、附睪炎、女性陰道炎、盆腔炎、宮頸炎等泌尿生殖道感染性疾病，是男女不孕、不育的主要病因。臨床上，病原微生物的分離培養鑑定是感染性疾病確診的「金標準」，但由於經典的液固雙相培養法對支原體的培養檢測繁瑣、耗時長(長達7 30天)，無法適用於臨床。近年單純的液體培養基培養法大大地縮短了培養時間，使支原體的分離培養鑑定和藥敏試驗成為了可能，但是假陽性與假陰性的問題限制了支原體液體分離培養基和支原體藥敏培養法在臨床上的應用。支原體液體分離培養基對支原體培養鑑定的原理是通過支原體在液體培養基中生長代謝而產酸或產鹼，進而使培養基中的指示劑變色，從而判斷是否有支原體的生長。而支原體藥敏培養法是在支原體液體分離培養基培養支原體的基礎上，増加支原體對相關藥物的敏感性測試。也就是說，支原體的液體分離培養基和藥敏培養法，其最根本的原理是微生物的代謝產物使培養液的酸鹼度(pH值)發生改變，並使其中的指示劑變色。可是代謝產物使培養液的酸鹼度(pH值)發生改變，並使其中的指示劑變色，卻不是支原體獨有的特性。某些雜菌(如葡萄球菌、白色念珠菌等)在生長代謝過程中，也可能產酸或產鹼，也能使指示劑變色。因此，通過顏色變化進行結果判斷的支原體液體分離培養法和藥敏培養法，雖然可通過指示劑變色來提示可能有支原體的生長，但有比較高的假陽性率；而市場上的某些品種，為了排除假陽性，設計為液體混濁為排除條件。這又使某些有支原體生長，尤其是某些合併有支原體生長者，被人為否定，造成假陰性。因此假陽性和假陰性問題，是幹擾支原體液體分離培養基和支原體藥敏培養法的結果判斷的最主要因素，也是限制其在臨床上應用的主要原因。本發明是在普通藥敏試驗板的基礎上，增設鑑別區，增加額外的藥敏鑑別試驗，從而可以在進行支原體藥敏培養的同時，對C+孔結果進行真偽鑑別。由於支原體是ー類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，沒有細胞壁，因此對作用於細菌細胞壁的抗生素(如β_內醯胺類藥物、萬古黴素)完全不敏感，對多粘黴素、利福黴素類、磺胺類藥物普遍耐藥；而大多數產酸或產鹼的細菌(如葡萄球菌等)對這幾類藥物，卻具有較高的敏感性。因此可以用這幾類藥物進行額外的藥敏鑑別試驗，排除大多數產酸或產鹼細菌所造成的假陽性與假陰性幹擾。而抗真菌類藥物，例如唑類或烷基胺類藥物藥物，主要通過抑制真菌細胞色素酶P450 (CYP) 14 α -脫甲基化酶，或抑制鯊烯環氧化酶，從而導致麥角烯醇耗竭，使真菌細胞膜 破裂和死亡，因此對真菌有高敏感性,而對支原體幾乎無作用。因此增加抗真菌藥物的藥敏鑑別試驗，可以排除真菌(尤其是白色念珠菌)所造成的假陽性與假陰性幹擾。即在進行支原體藥敏培養的同吋，增加對β-內醯胺類、磺胺類、利福黴素類、萬古黴素和抗真菌類藥物ー種或幾種藥物的額外的藥敏試驗，可對假陽性與假陰性的幹擾進行鑑別。只有當支原體液體培養試驗(C+孔)，與β-內醯胺類、磺胺類、利福黴素類、萬古黴素和抗真菌類藥物的藥敏試驗，均為陽性時，才為真性陽性。

發明內容
普通藥敏試驗板一般只有控制區、藥敏試驗區或加有培養基存放區2 3部分組成，本藥敏試驗板在此基礎上，增設鑑別區。因此本藥敏試驗板有培養基存放區(I)、控制區(2)、鑑別區(3)和藥敏試驗區⑷四個區域組成。鑑別區(3)可設計為一組小孔(2 5孔)，孔內包被有C+孔鑑別試驗所需的藥物，通常為對支原體不敏感，而對細菌、真菌敏感的藥物，如β -內醯胺類藥物、磺胺類藥物、利福黴素類、萬古黴素和抗真菌類等藥物中的ー種或幾種。在進行支原體藥敏試驗的同吋，對控制區C+孔的試驗結果進行鑑別。若是由其它雜菌(細菌或真菌)產生的幹擾，可通過鑑別區的C+孔鑑別試驗得以斟別若控制區(2)C+孔變色(陽性反應)，鑑別區(3)也全部變色，則表明真正有支原體感染；若控制區(2) C+孔變色(陽性反應)，而在鑑定區(3)只要一孔不變色(陰性)，則表明是由雜菌(細菌或真菌)產生的假陽性；若控制區(2)C+孔混濁，而在鑑別區(3)全部變色(陽性)，則表明是假陰性；若控制區(2) C+孔混濁，而在鑑別區(3)只要一孔不變色(陰性)，則表明是由雜菌(細菌或真菌)產生的幹擾，是真陰性。本藥敏試驗板其它各部分具體作用是培養基存放區(I)用於存放分離培養支原體的液體培養基(或稱試劑)小瓶，通常為ー較大的圓形孔，直徑以能放入試劑小瓶為度。控制區(2)通常設計為兩組小孔，分別進行陽性C+與陰性C_對照試驗。藥敏試驗區(4)通常設計為2 5組小孔，分別包被有對支原體敏感的藥物。具體參見附圖。本發明進行支原體藥敏檢測時，按下述步驟進行
步驟I :取支原體液體培養基，按說明書配製成培養液，並將試劑小瓶存入培養基存放區(I);步驟2 :按規定取上述培養液適量，加入控制區(2)的檢測孔C—中；步驟3 :將標本物，按規定投入培養基，按有關說明書操作規範制的含標本的培養液；步驟4 :取上步含標本的培養液10 100 μ L或規定體積，分別加入到控制區(2)的C+孔中和鑑別區(3)與藥敏試驗區(4)的所有藥敏試驗板孔中；步驟5 :根據有關說明書的規定，在藥敏試驗板的每個孔內滴加適量的礦物油、石蠟油或其它合適的物質，放止或減少液體的揮發；步驟6 :將藥敏試驗板置於35 38°C或規定溫度的孵育箱或其它合適的孵器中培養;步驟7 :2 36小時內觀察讀取結果，檢測標準簡述如下(或按有關說明書判讀)(I)若控制區(2)的C_孔變色，則表明試劑失效，試劑可能已被汙染或在試驗操作過程被汙染，試驗無效；(2)若控制區(2)的C+孔和C_孔均不變色，則表明無支原體生長，其餘孔不再判讀；(3)若控制區(2)的C_孔不變色，而C+孔變色，則繼續判讀鑑定區(3)a :若鑑別區(3)只要一孔不變色，則表明是其它雜菌產生的假陽性或假陰性，餘孔不再判讀；b :若鑑別區(3)全部變色，則表明有支原體感染，繼續對藥敏區(4)進行判讀①藥物高、中、低濃度孔均不變色，表示支原體對該列對應的藥物敏感； ②藥物高濃度孔不變色，而低濃度孔或中、低濃度孔均變色，表示支原體對該列對應的藥物中等敏感；③藥物高、中、低濃度孔均變色，表示支原體對該列對應的藥物不敏感；


附圖是示意圖 實施例培養基存放區(I)為ー較大的圓形孔，直徑足以能放入試劑小瓶。控制區(2)為上下兩孔，上為C+小孔，下為C-孔。鑑別區(3)為並列兩孔，分別包被有阿莫西林(AMO)和氟康唑(FLC)。藥敏試驗區(4)為兩排16孔，分別包被有こ醯螺旋黴素(ACE)、羅紅黴素(ROX)、阿奇黴素(AZI)、克林黴素(CLI)、多西環素(DOX)、左氧氟沙星(LEV)、加替沙星(GAT)、帕珠沙星(PAZ)共計八種抗菌素，其中上排為高濃度組，下排為低濃度組。以下結合本公司生產的肺炎支原體快檢試劑盒(6小時培養法)，對本藥敏檢測板的操作方法進行闡述。當取肺炎支原體快檢試劑盒(6小時培養法)中試劑，對肺炎支原體進行藥敏檢測吋，按下述步驟進行步驟I :取肺炎支原體快檢試劑I支，存入培養基存放區(I);步驟2 :取上述試劑50 μ L，加入控制區⑵的檢測孔C_中；
步驟3 :取咽拭子一枚，必要時用生理鹽水溼潤，在患者咽部捻轉數圈(採集儘量多的分泌物)，取出咽拭子，立即接種，或置於密閉試管內，適時接種。接種時，將咽拭子於試劑瓶內攪動數次，靠瓶壁擠盡殘留液,棄去咽拭子,試劑瓶中即為含標本的混合培養液。步驟4 :取上步含標本的混合培養液50 μ L，分別加入到控制區(2)的C+孔中和鑑別區(3)與藥敏試驗區(4)的所有藥敏試驗板孔中；步驟5 :在藥敏試驗板的每個孔內滴加礦物油I滴，放止揮發液體；步驟6 :將藥敏試驗板置於37 土 1°C孵育箱培養；步驟7 :6 12小時內觀察讀取結果，檢測標準如下(I)若控制區⑵的C_孔變為黃色，則表明試劑失效，試劑可能已被汙染或在試驗操作過程被汙染，試驗無效；
(2)若控制區(2)的C+孔和C_孔均不變色，仍為紅色或粉紅色，則表明無支原體生長，其餘孔不再判讀；(3)若控制區(2)的C_孔仍為紅色，而C+孔變為黃色或混濁，則繼續判讀鑑定區
(3)a :若鑑別區(3)阿莫西林(AMO)孔不變色，仍為紅色或粉紅色，則表明是由革蘭氏陽性菌引起的假陽性；b :若鑑別區(3)氟康唑(FLC)孔不變色，仍為紅色或粉紅色，則表明是由真菌(尤其是白色念珠菌)引起的假陽性；c :若鑑別區(3)全部變色，則表明有支原體感染，尤其是當C+孔變為黃色混濁，而阿莫西林(AMO)孔或氟康唑(FLC)孔變為清亮黃色者，可進ー步提示支原體合併有細菌或真菌感染。此時繼續對藥敏區(4)進行判讀①若藥物高、低濃度孔均不變色，表示支原體對該列對應的藥物敏感；如對於最後一列(帕珠沙星列)高低濃度孔均為紅色或粉紅色，則表示肺炎支原體對帕珠沙星敏感。②若藥物高濃度孔不變色，而低濃度孔變為黃色，表示肺炎支原體對該列對應的藥物中等敏感(中介)；③若藥物高、低濃度孔均變為黃色，表示肺炎支原體對該列對應的藥物不敏感(耐藥)。
權利要求
1.本發明涉及的藥敏試驗板，是在普通藥敏試驗板的基礎上，增設鑑別區，增加額外的鑑別試驗，可以在進行支原體藥敏培養的同時，對C+孔的結果進行真偽鑑別。
2.權利要求I所述的藥敏試驗板，其特徵在於由培養基存放區(I)、控制區(2)、鑑別區(3)和藥敏試驗區(4)四區域組成，但培養基存放區(I)可省略。
3.本發明所述的對C+孔的結果進行真偽鑑別的方法，是在藥敏試驗板的鑑別區(3)內包被對其它細菌或真菌抑制、殺滅作用強，而對支原體作用弱的藥物，具體可以為β_內醯胺類藥物、磺胺類藥物、利福黴素類、萬古黴素和抗真菌類等藥物中的ー種或幾種。
4.權利要求I所述的支原體，主要有肺炎支原體、解脲脲原體、人型支原體和生殖支原體等，但不僅限於此。
5.在權利要求I所述的試驗板中，所包被的對C+孔結果進行鑑別的物質為非抗支原體類或弱抗支原體類藥物。主要是β_內醯胺類藥物、磺胺類藥物、利福黴素類、萬古黴素和抗真菌類藥物,但不僅限於此。
全文摘要
本發明公開了一種支原體藥敏試驗板，是在普通藥敏試驗板的基礎上，增設鑑別區，可在進行支原體培養及藥敏試驗的同時，對C+孔的結果進行真偽鑑別。本發明同時還公開了一種對支原體陽性對照孔(C+孔)的結果進行真偽鑑別的方法，是通過在支原體藥敏試驗板的基礎上增加了培養結果性質的鑑別區，鑑別區內包被有非抗支原體類微生物的廣譜抗生素藥物，對陽性對照孔(C+孔)內容易導致假陽性、假陰性的雜菌進行抑制生長或者直接滅活，從而達到對培養結果的鑑別效果，具體包被的藥物可以為β-內醯胺類藥物、磺胺類藥物、利福黴素類、萬古黴素和抗真菌類等藥物中的一種或幾種。
文檔編號C12M1/34GK102676378SQ20111005966
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月14日 優先權日2011年3月14日
發明者嶽力群, 楊會宣 申請人:武漢菁華時間科技有限公司