一株具有腐殖質還原活性的玫瑰色庫克菌的製作方法
2023-06-10 16:00:26 1
專利名稱：一株具有腐殖質還原活性的玫瑰色庫克菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌及其應用，特別涉及一株玫瑰色庫克菌及其在厭氧條件下進行腐殖質還原的應用 。
背景技術：
腐殖質是土壤有機質的重要組成部分，廣泛存在於土壤、沉積物和水生環境中。研究證實，腐殖質可以通過吸附、絡合及氧化還原反應參與物質的生物地球化學循環，影響汙染物的轉化與歸宿。其中，腐殖質還原反應能夠促進環境中有機質的礦化和生物脫氮作用， 介導鐵、錳元素的形態轉化，促進有機汙染物的降解，影響重金屬的遷移轉化，具有重要的環境學意義及應用前景。腐殖質的微生物還原作用是指厭氧條件下，微生物在胞內氧化有機物釋放電子， 電子經胞內呼吸鏈傳遞到胞外腐殖質(電子受體)使其還原，並產生能量維持微生物自身生長的過程，這是微生物一類重要的胞外代謝形式，具有腐殖質還原能力的微生物成為腐殖質還原菌。到目前為止，已經有150多株腐殖質還原菌被分離得到，包括地桿菌 {Geobac ter sp.)、希瓦氏菌屬{Shewanella sp.)、脫亞硫酸菌屬 iPesulfi tobac teri um sp.)、產甲燒菌屬iMethanobacterium sp.)等,但至今未發現具有腐殖質還原活性的庫克菌 QCocuria sp.)。
發明內容
本發明的目的在於提供一種耐鹽鹼的腐殖質還原菌。本發明的另一個目的在於提供上述菌種在厭氧條件下還原腐殖質的應用。申請人:經過大量試驗研究，從海南省儋州市木薯渣堆肥樣品中分離純化得到一株玫瑰色庫克菌，具有較強的腐殖質還原能力，從而實現了本發明的目的。本發明提供的玫瑰色庫克菌iKocuria rosea HN01),於2012年2月23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路I號院，中科院微生物研究所)，保藏號為=CGMCC No. 5810，保藏中心建議的分類命名為心curia rosea。 保藏中心於2012年2月23日鑑定菌株是存活的。實驗數據表明，本發明菌株在厭氧條件下能耦聯電子供體(如葡萄糖、鹿糖、甲醇、乙醇或丙三醇)的氧化，還原腐殖質模式物蒽醌_2，6-二苯磺酸(AQDS)。與多株已報導的腐殖質還原菌相比，該菌株具有耐鹽鹼特性，電子利用譜廣特點。本發明的菌株，具有良好的應用前景。
圖I是本發明菌株的1000倍光學顯微圖。
具體實施方式
玫瑰色庫克菌的富集、分離及純化
1)取5g堆肥樣品於IOOmL液體分離培養基中，每升液體分離培養基中含I.Og葡萄糖 (電子供體)、0. 412g AQDS (蒽醌-2，6-二苯磺酸，電子受體，腐殖質模式物)、2. 5g NaHC03、
·0.25g NH4CUO. 678g NaH2PO4 2H20、0. Ig KCl ,10. OmL 維生素溶液、10. OmL 微量元素溶液， pH值為10，其中，維生素溶液是每升去離子水中含5. Omg葉酸、0. 2mg維生素B6、6. 5mg維生素B2、3. Omg維生素BlUOmg煙醯胺、Img泛酸鈣、0. 2mg維生素B12、2. Omg維生素H ;微量元素溶液是每升去離子水中含I. 6g乙二胺四乙酸、3. Og MgSO4 7H20、0. 5g MnSO4 H2O,
·1.Og NaCU0. Ig CoCl2 6H20、0. Ig CaCl2,0. Olg CuSO4 5H20、0. Olg AlK(SO4)2 12H20、 0. Olg H3B03、0. 025g Na2MoO4 2H20 ；
2)往已接種樣品的培養液中鼓充高純混合氣體(N2/C02=80/20)>30分鐘，鼓氣完畢蓋橡膠蓋加鋁蓋密封，37 °C靜置培養，觀察培養液的顏色變化情況；
3)當培養液顏色由無色變為橙紅色直至不再變化時，以10%的接種量轉接富集培養三
次；
4)最後，將第四代反應後的培養液進行適當稀釋後均勻塗布於固體分離培養基上(固體分離培養基為每升液體分離培養基中加入18g瓊脂粉)，30°C培養48h，挑取單菌落進行單菌落分離與純化；
5)將純化得到的單菌落重新接到新鮮的厭氧液體培養基中，靜置厭氧培養，驗證菌株對AQDS的還原特性。本發明菌株的形態特徵
(I)菌體形態特性
採用常規的光學顯微鏡下觀察，該菌株為革蘭氏陽性菌，球狀，四聯或八聯形式排列。(2)菌落形態特徵
在pH為8. 5的牛肉膏蛋白腖瓊脂固體培養基平板上30°C好氧培養48小時後觀察，菌落呈玫瑰粉色，表面光滑，不透明，邊緣整齊，菌落直徑為2 3mm。本發明菌株的生理生化特徵
該菌具兼性厭氧生長能力，在厭氧條件下，能以葡萄糖、蔗糖、甲醇、乙醇或丙三醇為電子供體，還原AQDS。其他已經測定的生理生化特徵見表I。
權利要求
1.一株玫瑰色庫克菌，其保藏號為CGMCC No. 5810。
2.權利要求I所述玫瑰色庫克菌在腐殖質還原中的應用。
全文摘要
本發明公開了一株具有腐殖質還原活性的玫瑰色庫克菌及其應用。該菌株的保藏號為CGMCC No.5810。與多株已報導的腐殖質還原菌相比，該菌株具有耐鹽鹼特性，電子利用譜廣，具有很好的腐殖質還原特性。
文檔編號C09K17/00GK102618463SQ201210077990
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月22日 優先權日2012年3月22日
發明者李勤奮, 武春媛, 陳楠 申請人:中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所