組織型纖溶酶原激活劑突變體的復性分離純化方法
2023-06-10 13:50:06 2
專利名稱：組織型纖溶酶原激活劑突變體的復性分離純化方法
技術領域：
本發明屬於醫藥生物技術重組蛋白分離純化技術領域。
二.
背景技術：
瑞替普酶是一種用基因定點突變技術，在大腸桿菌中表達生產的基因重組人組織型纖溶酶原激活劑突變體。屬於單鏈無糖基化多肽，含355個胺基酸，具有天然人組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，t-PA)的1～3，176～527號胺基酸編碼序列。只攜帶野生型t-PA的kringle2結構域和蛋白酶結構域的瑞替普酶，以其16～20分鐘較長的半衰期，更快更徹底的溶栓作用和較少顱內出血危險等優點成為較為理想的溶血栓藥物。
由於瑞替普酶含有10對二硫鍵，在大腸桿菌中表達時形成包涵體形式，溶解變性後用常規方法復性很難正確摺疊和復性成活性狀態。這是由於組成十對二硫鍵的20個半胱氨酸在復性時錯誤配對造成的。而用還原型和氧化型穀胱甘肽與其它復性試劑按一定比例復性瑞替普酶雖能獲得成功，但成本卻十分昂貴。
三.
發明內容
為了提高變性瑞替普酶的復性率，降低瑞替普酶的生產成本，我們發明了設計含有(His)6和factor Xa切割位點的上遊引物以擴增瑞替普酶，六個組氨酸為純化標籤與瑞替普酶融合表達，兩段之間加有factor Xa以除去純化標籤獲得正確的目的蛋白。然後把瑞替普酶插入合適的表達載體中進行融合表達。如此融合表達的瑞替普酶在適當的條件下在Ni2+-HiTrap柱上，可以復性、分離純化一步完成。所用試劑都是普通級別的，而且步驟簡單。本發明不但簡化了復性分離純化的程序，還能提高復性率，最終提高瑞替普酶的產率，大大降低生產成本，並能應用於工業化生產。
本發明需要解決的問題是用低廉的普通的一些試劑在適當的條件下，促進瑞替普酶形成正確配對的二硫鍵，完成分子結構重排，形成正確活性形式，達到復性目的。同時設計了(His)6純化標籤以簡化後續的分離純化，(His)6純化標籤與瑞替普酶之間的factor Xa切割位點，用factor Xa在瑞替普酶復性後去掉(His)6純化標籤，獲得正確的目的蛋白。這樣就簡化了瑞替普酶的下遊工藝，節約生產成本。
技術方案本發明用尿素變性包涵體的溶解液中加入一定量的咪唑和2-巰基乙醇，以促進瑞替普酶的復性。
設計含有(His)6和factor Xa切割位點的上遊引物擴增瑞替普酶→大腸桿菌表達瑞替普酶→收集菌體，超聲破碎→分離包涵體→尿素變性溶解，變性液中有低濃度咪唑和2-巰基乙醇→在Ni2+-HiTrap柱上復性與分離純化一步完成。經上述步驟，即可製備得到純度大於96％，有活性的瑞替普酶。
本發明的優點本發明提供了一種快速而低廉的促進瑞替普酶復性的新型工藝方法，它與現有的瑞替普酶生產工藝相比具有以下優點；(1)變性的瑞替普酶復性率高。(2)復性體系中的瑞替普酶蛋白濃度提高，復性體積減少，節約時間。(3)所用試劑均為常用、低廉的普通級別，大大節省復性成本。(4)復性、分離純化都在柱上一步完成，極大限度的減少瑞替普酶的損失，提高瑞替普酶產率。這些優勢使本發明具有十分明顯的技術性和工藝先進性。而成本的降低，使瑞替普酶更適合於工業化生產，為瑞替普酶後續的普及應用奠定堅實的基礎。
四.
圖1.瑞替普酶柱上復性純化後的活性測定。
五.
具體實施例方式
瑞替普酶製備方法如下將表達後的瑞替普酶工程菌菌體收集，懸浮於20mM Tris-HclPH8.0，超聲破碎並在4℃ 12000rpm，離心15分鐘，收集包涵體。包涵體用溶液I，其組分為6～8M尿素、10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～5mM 2-巰基乙醇PH8.0，室溫攪動，充分溶解後，4℃ 12000rpm，離心15分鐘，取上清，用0.22um或0.45um的濾膜過濾，就可以獲得變性的瑞替普酶溶液。
變性的瑞替普酶通過過柱前已用溶液I平衡的Ni2+-HiTrap柱，上樣後，先用兩倍柱體積的溶液I和溶液II，溶液II的組分為6～8M尿素、10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、20～500mM咪唑、0～100mM 2-巰基乙醇PH7～10，各洗滌一次，再以六倍柱體積的不含尿素的溶液III，溶液III的組分為10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～100mM2-巰基乙醇PH7～10洗滌。這一步驟之後，可加兩倍到四倍柱體積的溶液IV，其組分為10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、50mM～1M咪唑、0～5mM 2-巰基乙醇PH7～10，洗脫已摺疊有活性的瑞替普酶。或在洗滌完後加入factor Xa，使之在柱上切割(His)6。最後用適當濃度的NaCl洗脫有活性的瑞替普酶，得到正確的有活性的目的蛋白。
權利要求
1.一種組織型纖溶酶原激活劑重組突變體39KD瑞替普酶的復性方法，其特徵在於用尿素變性包涵體的溶解液中加入一定量的咪唑和2-巰基乙醇，以促進瑞替普酶的復性。
2.根據權利要求1所述，組織型纖溶酶原激活劑重組突變體39KD的瑞替普酶的復性分離純化方法，其特徵在於設計含有(His)6和factor Xa切割位點的上遊引物擴增瑞替普酶→大腸桿菌誘導融合表達瑞替普酶→收集菌體，超聲破碎→分離包涵體→尿素變性溶解(有低濃度咪唑和2-巰基乙醇)→在Ni2+-HiTrap柱上分離純化與復性一步完成。
3.根據權利要求2所述，組織型纖溶酶原激活劑重組突變體39KD瑞替普酶的變性，其特徵是以尿素為變性劑，變性溶液中含6～8M尿素，10～50mMTris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～100mM 2-巰基乙醇PH7～10。
4.根據權利要求2所述，組織型纖溶酶原激活劑重組突變體39KD瑞替普酶的復性，其特徵在於復性的過程是咪唑和尿素量的變化過程。咪唑的濃度逐漸加大，而尿素的量逐漸減少，直至沒有。上樣後復性是分三步洗滌，溶液的先後順序為兩倍柱體積的溶液I，溶液組分為6～8M尿素、10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～5mM 2-巰基乙醇PH7～10→兩倍柱體積的溶液II，溶液組分為6～8M尿素、10～100mMTris-Hcl、0.5M NaCl、20～500mM咪唑、0～100mM 2-巰基乙醇PH7～10→六倍體積的溶液III，溶液組分為10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、1～100mM咪唑、0～100mM 2-巰基乙醇PH7～10。
5.根據權利要求4所述溶液I、II、III洗滌完畢後，用兩到四倍柱體積的溶液IV，其溶液組分為10～100mM Tris-Hcl、0.5M NaCl、50mM～1M咪唑、0～100mM 2-巰基乙醇PH7～10，洗脫摺疊復性的組織型纖溶酶原激活劑重組突變體39KD的瑞替普酶。
6.根據權利要求4所述溶液I、II、III洗滌完畢後，加入factor Xa，使之在柱上切割(His)6。最後用適當濃度的NaCl洗脫有活性的瑞替普酶。
全文摘要
本發明屬於醫藥生物技術重組蛋白分離純化技術領域，公開了一種用低廉、普通級別的常用試劑咪唑和尿素，以它們的濃度梯度在合適的條件下，使在大腸桿菌中與(His)
文檔編號C12N9/00GK1556206SQ200410013849
公開日2004年12月22日 申請日期2004年1月8日 優先權日2004年1月8日
發明者沈子龍, 廖建民, 孫石靜, 張新元 申請人:中國藥科大學