基於碳納米材料的免疫分析方法
2023-07-01 08:21:36
專利名稱：基於碳納米材料的免疫分析方法
技術領域：
本發明屬於免疫檢測和分析領域，具體涉及ー種基於碳納米材料(碳點)的免疫分析方法。
背景技術：
免疫分析因其獨有的特異性，在臨床診斷和環境檢測等方面得到廣泛利用。在免疫分析諸多的檢測方法中，化學發光檢測方法因其靈敏度高、線性範圍寬、儀器簡單、分析快速和自動化程度高等優點得到重視。目前常用的化學發光免疫分析的常用標記可以分為三類。其一，化學發光物質直接標記。 該類物質主要有醯肼類化合物(例如魯米諾，異魯米諾及其衍生物)、吖啶酯及其衍生物、和咪唑類化合物。魯米諾及其衍生物必須在適當的催化劑存在下才可以觀測其化學發光反應。吖啶酯及其衍生物在雙氧水的引發下可直接完成瞬時發光；但吖啶酯的穩定性及吖啶酯衍生物的製備是限制該標記物廣泛應用的因素。其ニ，使用酶對免疫試劑進行標記。因以酶所用底物作為發光劑，故可將其歸類於化學發光免疫分析。目前常用的酶標記物有辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等。在免疫試劑的標記和保存過程中需考慮酶活性保持等問題。其三，納米材料標誌物。納米材料是指三位空間尺寸中至少有ー維處於納米數量級的材料。因其尺寸處於納米級別，使其具有特殊的光電性質。在免疫分析中，常用的納米材料標記物有金屬納米粒子、CdTe和CdSe等半導體量子點、螢光二氧化矽納米球、和納米稀土螢光配合物材料等。盧建忠研究小組使用納米金作為標記物，在免疫反應之後用溴水等氧化物質將其氧化成三價金離子，利用其對魯米諾發光體系的催化作用進行檢測[A. P. Fan et al.，Anal. Chem.，2005，77:3238]。李等利用硝酸和鹽酸將金納米離子溶解後，用於發光體系[Z. P. Li et al., Anal. Chim.Acta, 2005, 551:85];方法需要引進毒性較大或氧化性的物質，不是最為理想的。CdTe和CdSe等半導體量子點雖具有傳統螢光染料試劑不具備的特點，諸如光穩定性好，發光強度高，激發光譜寬，發光光譜狹窄以及螢光壽命長等的優點，但是大多數光學性能好的量子點均含有重金屬物質，存在一定的生物毒害性，其真正的應用還有很多問題需要解決。因此在化學發光免疫分析中，光學性能優異，且穩定好，無毒害作用的標記物的開發具有極其重要的意義。碳點是ー類生物兼容性好，且光學性能優異的碳納米材料。碳點在免疫分析中的應用很少；目前僅有將其作為抗體載體，用於電化學免疫分析的報導[D. Du et al.，Anal.Chem.，2010，82:2989] [R. J. Cui et al. , Adv. Funct. Mater. 2008，18:2197]。其優異的光學性能尚未在免疫分析中得到應用。
發明內容
本發明中，發明人合成ー種具備螢光性質且光學性能穩定的碳納米材料粒子。當其與ー些氧化試劑共存時候，可以觀察到很強的化學發光。通過紅外表徵，該材料表面具備豐富的羧基和羥基官能團，證實該材料具有很好的生物標記前景。在對該材料進行免疫試劑標記之後，利用其可以建立高靈敏且安全無毒的免疫分析方法。
本發明提供ー種基於碳納米材料(碳點)的免疫分析方法，包括如下步驟步驟A，製備碳點並在碳點的表面標記免疫試劑抗原或抗體，使之成為免疫試劑標記碳點；步驟B,將免疫試劑標記碳點、待測樣本、以及免疫試劑抗原或抗體包被的固相物質混合完成免疫反應形成免疫複合物；將所述免疫複合物與游離免疫試劑進行分離；和步驟C，對所述免疫複合物加入氧化劑進行化學發光檢測，和/或對其直接進行螢光檢測。依據本發明，優選所述碳點為以PEG1500、甘油和絲氨酸混合製備得到。合成本發明中碳納米材料的途徑有兩種。第一種，微波加熱法合成利用微波加熱的方式將PEG1500和甘油先混合，在微波加熱下形成透明黏稠狀液體，而後加入碳源絲氨酸，利用微波對碳源進ー步加熱，使得試劑之間互相交聯形成碳點(碳納米材料)；第二種，水熱法合成法將PEG1500、甘油和絲氨酸放入反應釜中，密封反應釜後於250°C加熱3小時即得。本發明中，所述碳點粒徑優選為3 4nm，其表面帶有羧基和羥基基團。3_4nm的碳點在免疫試劑上的標記對免疫試劑生物活性影響較小，且碳點材料原料無毒、環保。在本發明中，所述步驟A中碳點與免疫試劑抗原或抗體的結合為化學鍵直接結合 或生物方法間接鍵合。所述化學鍵直接結合，即碳點通過化學共價鍵直接和免疫試劑(特異性抗原或抗體)相連，因在碳納米材料上有豐富的羧基基團，則如利用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及其水溶性同系物Sulfo-NHS與縮合劑如1-(3- ニ甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亞胺鹽酸鹽與碳納米材料表面的羧基混合後反應生成具有氨基反應活性的NHS活潑酷，而後將其與免疫試劑上的氨基進行結合，實現碳納米材料的免疫試劑標記。所述生物方法間接鍵合，即通過間接方式將碳點與免疫試劑偶聯，具體使用如生物素-親和素方式、互補DNA之間的相互作用方式等方式。例如，將免疫試劑進行生物素化，而碳納米材料與親和素結合，通過生物素-親和素之間特異性以及強作用力，將免疫試劑與碳納米材料相連。優選所述步驟B中固相物質為磁性顆粒、聚合物微球、玻璃微珠和96孔微板中的ー種或多種。在本發明中，所述步驟B中待測樣本優選為小分子目標物或者大分子目標物；具體為小分子抗體、抗原，或為大分子抗體、抗原。且可根據待測樣本的特點，選擇所述步驟B中免疫反應的模式為夾心反應模式或競爭反應模式。在所述夾心反應模式中，其免疫反應的完成採取如下兩種方式之一即待測樣本、免疫試劑包被的固相物質混合發生免疫反應形成ー種免疫複合物，再與免疫試劑標記碳點混合形成免疫複合物(兩步法)；或者免疫試劑標記碳點、待測樣本、以及免疫試劑包被的固相物質三者混合發生免疫反應形成免疫複合物(ー步法)。本發明中，優選步驟C中所述化學發光檢測為氧化劑與碳點產生化學發光後，由光電倍增管對產生的化學發光強度進行採集記錄；所述螢光檢測為使用螢光分光光度計對碳點的螢光強度進行檢測。優選本發明的步驟A中用磷酸鹽緩衝液洗滌和/或保存所述免疫試劑標記碳點，在步驟B中用磷酸鹽緩衝液洗滌所述免疫複合物；所述磷酸鹽緩衝液由磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鈉、氯化鈉和氯化鉀溶液組成；步驟C中所述氧化劑為高錳酸鉀、硫酸鈰、高碘酸鉀和鐵氰化鉀中的ー種或多種。在本發明中，利用該碳納米材料可進行化學發光和螢光兩種免疫檢測，其光學穩定性好。在化學發光免疫檢測中，直接加入単一的氧化物質如硫酸鈰、高錳酸鉀或鐵氰化鉀等強氧化劑便能引發化學發光反應；避免傳統方法中複雜的化學發光底物的製備和保存問題。
圖I是碳納米材料的螢光光譜圖；圖2是碳納米材料的紅外表徵圖；圖3是免疫反應的模式圖(上為雙抗體夾心模式，下為競爭法模式)；圖4是免疫檢測IgG時化學發光強度與螢光強度隨IgG濃度變化圖。
具體實施例方式以下實施方式僅為本發明的優選實施例，不能以此限制本發明的範圍。實施例I一、螢光碳納米材料的合成微波加熱法合成螢光碳納米材料將I. Og PEG1500和15mL甘油混合，微波加熱I分鐘後形成透明黏稠狀液體，而後加入O. 5g絲氨酸作碳源，利用微波對該混合物加熱10分鐘，試劑之間互相交聯形成碳點；通過透析除去雜質後，將碳點存儲於4°C冰箱，或將碳點旋轉蒸乾後保存。水熱法合成螢光碳納米材料將I. Og PEG1500、15mL甘油和O. 5g絲氨酸混於反應釜中，密封后於250°C加熱3小時；待其恢復至室溫，通過透析除去雜質後，將碳點存儲於4°C冰箱。不管是以微波加熱法還是水熱法合成的螢光碳納米材料，其碳點性質相同；圖I為碳點的螢光光譜圖，從左至右激發波長由260nm開始，依次遞增20nm;從圖可見，碳點具有強螢光發射峰且發射峰的位置與其激發波長有光。圖2為碳點的紅外光譜表徵圖；從圖中可知碳點表面含有豐富的羥基和羧基結構，這非常有利於碳點與生物物質的結合。ニ、碳點在羊抗人IgG上的標記取5mg碳點將其溶於ImL O. OlM磷酸鹽緩衝液中，加入O. 4mg的1_(3_ ニ甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亞胺鹽酸鹽和O. 6mg的N-羥基琥珀醯亞胺，室溫反應15分鐘；再加入I. 4 μ L2-巰基こ醇淬滅EDC ;在反應液中加入Img羊抗人IgG，室溫反應2小時；然後用O. OlM賴氨酸封閉碳點上多餘的氨基結合位點以減小非特異吸附。將上述溶液轉移至透析袋中透析過夜後，於磷酸鹽緩衝液中密封保存。三、磁性微粒子與抗體的結合取ImL羧基修飾的磁性微粒子(5mg/mL)，將其置於O. OlM磷酸鹽緩衝液中，加入
O.4mg EDC和O. 6mg NHS,室溫反應15分鐘；再加入I. 4 μ L 2-巰基こ醇淬滅EDC ;在反應液中加入Img兔抗人IgG，室溫反應2小時；然後用O. OlM賴氨酸封閉碳點上多餘的氨基結合位點以減小非特異吸附；最後通過磁性分離將與磁性微粒子結合的抗體與未結合的抗體相分離。四、夾心反應模式的免疫反應及其免疫檢測在此實施例中，待測樣本為人IgG。該免疫分析方法(免疫反應)可使用ー步法和兩步法。ー步法將IgG抗原、碳點標記羊抗人IgG和磁性微粒子標記的兔抗人IgG進行混合，在37°C下反應I小時形成免疫複合物；利用磁性微粒子的磁性將形成的免疫複合物與游離的免疫試劑相分離；加入氧化試劑硫酸鈰或高錳酸鉀，使其與碳點作用發生化學發光反應，使用BPCL超微弱化學發光檢測儀對該體系產生的光學信號進行採集。或者採用螢光分光光度計，對免疫複合物上碳點的螢光強度進行定量。從圖4可見，化學發光檢測和螢光檢測均能準確地檢出碳點信號。兩步法將IgG抗原和磁性微粒子標記的兔抗人IgG進行混合，在37°C下反應I小時形成免疫複合物；利用磁性微粒子的磁性將形成的免疫複合物與游離的免疫試劑相分離；在上述複合物中加入碳點標記羊抗人IgG，使之形成磁顆粒兔抗人IgG-人IgG-碳點標記羊抗人IgG免疫複合物，於37°C反應I小時後，利用磁性分離出免疫複合物；加入氧化試劑硫酸鈰或高錳酸鉀，使其與碳點作用發生化學發光反應，使用BPCL超微弱化學發光檢測儀對該體系產生的光學信號進行採集。或者採用螢光分光光度計，對免疫複合物上碳點的螢光強度進行定量。上述方法中，不論使用一步法還是兩步法，均能順利實現本發明的免疫分析目的。
需要說明的是，在本發明中，待測樣本可以為抗原或抗體。圖3反應模式中的待測樣本均顯示為抗原形式，實質上該待測樣本身可以是ー種抗體，如本實施例中「人IgG」本身是ー種抗體，在此例和此圖中卻顯示為待測樣本抗原並作為抗原使用；相應的「羊抗人IgG」即為其抗原「人IgG」的抗體。實施例2競爭反應模式的免疫反應及其免疫檢測在此實施例中，待測樣本為疾病標誌物。具體為大分子疾病標誌物如腫瘤標誌物CA153、CEA和AFP等，或為小分子化合物如三碘甲腺原氨酸、雌ニ醇和雌三醇等。首先使用如實施例I中步驟三相似的方法將抗小分子抗體(如抗三碘甲腺原氨酸抗體)與磁性顆粒結合；然後使用如實施例I中步驟二相似的方法將小分子標準物質三碘甲腺原氨酸進行碳點標記；再將抗體磁顆粒複合物、該碳點標記三碘甲腺原氨酸(免疫碳點)、以及待測樣本溶液加入反應器內進行競爭反應I小時後形成免疫複合物，利用磁性分離器分離出免疫複合物。加入氧化試劑硫酸鈰或高錳酸鉀，使其與碳點作用發生化學發光反應，使用BPCL超微弱化學發光檢測儀對該體系產生的光學信號進行採集。或者採用螢光分光光度計，對免疫複合物上碳點的螢光強度進行定量。
權利要求
1.一種基於碳納米材料的免疫分析方法，其中，所述碳納米材料又稱為碳點，所述方法 包括如下步驟步驟A，製備碳點並在碳點的表面標記免疫試劑抗原或抗體，使之成為免疫試劑標記碳點步驟8，將免疫試劑標記碳點、待測樣本、以及免疫試劑抗原或抗體包被的固相物質混 合完成免疫反應形成免疫複合物；將所述免疫複合物與游離免疫試劑進行分離；步驟〔，對所述免疫複合物加入氧化劑進行化學發光檢測，和/或對其直接進行螢光檢測。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述碳點為以？661500、甘油和絲氨酸混 合製備得到，碳點製備方法為微波合成法或水熱合成法。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述碳點粒徑為3、_，其表面帶有羧基和羥基基團。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟ム中碳點與免疫試劑抗原或抗體 的結合為化學鍵直接結合或生物方法間接鍵合。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟8中固相物質為磁性顆粒、聚合 物微球、玻璃微珠和96孔微板中的一種或多種。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟B中待測樣本為小分子目標物或 者大分子目標物。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，根據待測樣本的特點，選擇所述步驟8中 免疫反應的模式為夾心反應模式或競爭反應模式。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述步驟8中夾心反應模式免疫反應的完 成採取如下兩種方式之一即待測樣本、免疫試劑包被的固相物質混合發生免疫反應形成 一種免疫複合物，再與免疫試劑標記碳點混合形成免疫複合物；或者免疫試劑標記碳點、待 測樣本、以及免疫試劑包被的固相物質三者混合發生免疫反應形成免疫複合物。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟C中所述化學發光檢測為氧化劑與碳 點產生化學發光後，由光電倍增管對產生的化學發光強度進行採集記錄；所述螢光檢測為 使用螢光分光光度計對碳點的螢光強度進行檢測。
10.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟ム中用磷酸鹽緩衝液洗滌和/或 保存所述免疫試劑標記碳點，在步驟8中用磷酸鹽緩衝液洗滌所述免疫複合物；所述磷酸 鹽緩衝液由磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉和氯化鉀溶液組成；步驟〔中所述氧化劑為高 錳酸鉀、硫酸鈰、高碘酸鉀和鐵氰化鉀中的一種或多種。
全文摘要
本發明提供一種基於碳納米材料(碳點)的免疫檢測方法，包括如下步驟步驟A，製備碳點並在碳點的表面標記免疫試劑抗原或抗體，使之成為免疫試劑標記碳點；步驟B，將免疫試劑標記碳點、待測樣本、以及免疫試劑抗原或抗體包被的固相物質混合完成免疫反應形成免疫複合物；將所述免疫複合物與游離免疫試劑進行分離；和步驟C，對所述免疫複合物加入氧化劑進行化學發光檢測，和/或對其直接進行螢光檢測。在本發明中，利用該碳納米材料可進行化學發光和螢光兩種免疫檢測，其光學穩定性好。
文檔編號G01N33/53GK102662049SQ20121013898
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月7日 優先權日2012年5月7日
發明者周雲, 張煒奮, 林珍, 林金明 申請人:清華大學