重組人內皮抑素在大腸桿菌中的高效表達技術的製作方法

2023-06-28 15:48:46

專利名稱：重組人內皮抑素在大腸桿菌中的高效表達技術的製作方法
技術領域：
本發明屬於重組人內皮抑素在大腸桿菌中高效表達的技術。
背景技術：
內皮抑素是哈佛大學O′Reilly MS在1997年的Cell雜誌第88卷第2期277～285頁的文章中提出發現的一種新的血管生成抑制因子，與傳統抗腫瘤藥物相比較，內皮抑素通過抑制腫瘤相關的新血管的生成來阻斷腫瘤組織的血液供應，從而發揮抑制腫瘤生長與轉移作用。內皮抑素抑制的靶細胞是血管內皮細胞而不是腫瘤細胞本身，所以有廣泛的抗癌譜，且反覆用藥不會引起耐藥性的產生。目前內皮抑素的原核表達主要採用大腸桿菌表達系統，曲建在上海大學學報(自然科學版)2000年第六卷第四期338-342頁的文章中提出，利用pSQE載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)進行內皮抑素的表達，重組蛋白的表達量達菌體總蛋白的30％。
應用內皮抑素治療腫瘤，療程長且用量大。對於現在採用的內皮抑素蛋白原核表達體系，重組蛋白的表達效率還有待提高，最多不超過菌體總蛋白的30％，難以滿足臨床應用的需要。

發明內容
本發明的目的是提供一種重組人內皮抑素在大腸桿菌中的高效表達技術。
本發明通過建立合適的誘導表達條件在較短的周期裡表達出大量的重組蛋白質，提高內皮抑素的產量，以利於降低生產成本及產品價格，促進內皮抑素在臨床的普遍應用。
本發明選擇IPTG誘導表達技術實現人內皮抑素基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效表達。從胚肝組織中提取肝細胞總RNA，通過逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術獲得人內皮抑素基因，將其插入原核表達載體pET28b中構建重組表達質粒pBendo，然後轉化表達型大腸桿菌BL21(DE3)中，篩選出陽性重組菌E.coli BL21-Endo，採用新的誘導表達條件進行重組蛋白的表達。
本發明將重組質粒pBendo轉化表達型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽性重組菌E.coli BL21-Endo，接種於2mL、含60～90μg/mL卡那黴素(Kan)的LB培養液中，LB培養液的組分是1％胰化蛋白腖、0.5％酵母提取物和1％NaCl。在細菌培養箱中，35～38℃，180～220rpm振蕩培養12～16h，然後將菌液接種於200mL、含60～90μg/mL Kan的LB培養液中，36～38℃，200～250rpm振蕩培養2～3h，使菌液OD600nm在0.4～0.6，向菌液中加入終濃度為0.8～1.0m mol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在36～37℃下，180～200rpm繼續振蕩培養3～5h誘導內皮抑素的表達，表達量達到菌體總蛋白的38％。
採用新的大腸桿菌表達條件，實現重組蛋白表達量達到菌體總蛋白的38％，高於已報導的方法。
具體實施例方式
實施例1將重組質粒pBendo轉化表達型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽性重組菌E.coli BL21-Endo，接種於2mL、含90μg/mL Kan的LB培養液中，在細菌培養箱中，38℃，220rpm振蕩培養14h，然後將菌液接種於200mL、含90μg/mL Kan的LB培養液中，38℃，250rpm振蕩培養2.5h，使菌液OD600nm在0.6。向菌液中加入終濃度為1.0m mol/L的IPTG，在37℃下，200rpm繼續振蕩培養5h誘導內皮抑素的表達。
實施例2；將重組質粒pBendo轉化表達型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽性重組菌E.coli BL21-Endo，接種於2mL、含60μg/mL Kan的LB培養液中，在細菌培養箱中，35℃，180rpm振蕩培養16h，然後將菌液接種於200mL、含60μg/mL Kan的LB培養液中，36℃，200rpm振蕩培養2h，使菌液OD600nm在0.4。向菌液中加入終濃度為0.8m mol/L的IPTG，在36℃下，180rpm繼續振蕩培養3h誘導內皮抑素的表達。
實施例3將重組質粒pBendo轉化表達型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽性重組菌E.coli BL21-Endo，接種於2mL、含70μg/mL Kan的LB培養液中，在細菌培養箱中，37℃，200rpm振蕩培養12h，然後將菌液接種於200mL、含70μg/mL Kan的LB培養液中，37℃，220rpm振蕩培養2.5h，使菌液OD600nm在0.5。向菌液中加入終濃度為0.9m mol/L的IPTG，在36.5℃下，190rpm繼續振蕩培養4h誘導內皮抑素的表達。
實施例4將重組質粒pBendo轉化表達型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽性重組菌E.coli BL21-Endo，接種於2mL、含70μg/mL Kan的LB培養液中，在細菌培養箱中，37℃，220rpm振蕩培養14h，然後將菌液接種於200mL、含70μg/mL Kan的LB培養液中，36℃，250rpm振蕩培養3h，使菌液OD600nm在0.6。向菌液中加入終濃度為0.8m mol/L的IPTG，在37℃下，200rpm繼續振蕩培養4h誘導內皮抑素的表達。
實施例5將重組質粒pBendo轉化表達型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽性重組菌E.coli BL21-Endo，接種於2mL、含80μg/mL Kan的LB培養液中，在細菌培養箱中，38℃，180rpm振蕩培養12h，然後將菌液接種於200mL、含80μg/mL Kan的LB培養液中，37℃，220rpm振蕩培養3h，使菌液OD600nm在0.6。向菌液中加入終濃度為1.0m mol/L的IPTG，在36℃下，190rpm繼續振蕩培養5h誘導內皮抑素的表達。
實施例6將重組質粒pBendo轉化表達型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽性重組菌E.coli BL21-Endo，接種於2mL、含70μg/mL Kan的LB培養液中，在細菌培養箱中，37℃，200rpm振蕩培養16h，然後將菌液接種於200mL、含70μg/mL Kan的LB培養液中，38℃，200rpm振蕩培養2.5h，使菌液OD600nm在0.5。向菌液中加入終濃度為0.9m mol/L的IPTG，在37℃下，200rpm繼續振蕩培養3h誘導內皮抑素表達。
權利要求
1.一種重組人內皮抑素在大腸桿菌中的高效表達技術，將重組質粒pBendo轉化表達型宿主菌E.coli BL21(DE3)中，篩選出陽性重組菌E.coli BL21-Endo，接種於2mL、含60～90μg/mL卡那黴素的LB培養液中，在細菌培養箱中，35～38℃，180～220rpm振蕩培養12～16h，然後將菌液接種於200mL、含60～90μg/mL Kan的LB培養液中，36～38℃，200～250rpm振蕩培養2～3h，使菌液OD600nm在0.4～0.6，向菌液中加入終濃度為0.8～1.0mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在36～37℃下，180～200rpm繼續振蕩培養3～5h誘導內皮抑素的表達，表達量達到菌體總蛋白的38％。
全文摘要
本發明屬於重組人內皮抑素在大腸桿菌中高效表達的技術領域。將人內皮抑素基因其插入原核表達載體pET28b中構建重組表達質粒pBendo，然後轉化大腸桿菌BL21(DE3)中，篩選出陽性重組菌E.coli BL21－Endo，在含卡那黴素的LB培養液中振蕩培養，使菌液OD
文檔編號C12N1/21GK1546671SQ200310115938
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月16日 優先權日2003年12月16日
發明者王群, 王 群 申請人:中國科學院長春應用化學研究所