一種抗pedf單克隆抗體及其製備方法和應用的製作方法

2023-07-01 00:11:56 1

專利名稱：一種抗pedf單克隆抗體及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種抗PEDF單克隆抗體及其製備方法和應用。
背景技術：
糖尿病微血管併發症(diabetic microvascular complication)是糖尿病患者致殘、致死的主要原因。越來越多的研究表明由於血管新生(angiogensis)的受抑制，糖尿病患者的局部創傷癒合(wound healing)出現障礙,研究估計15%的糖尿病患者出現糖尿病足(diabetic foot)。目前國內外尚無特效治療手段，每年導致72，000病人截肢。糖尿病足發生的病因除了反覆創傷、細菌感染外，創傷癒合受損(impaired wound healing)是其中一個重要因素。在特定的情況下，如糖尿病的發生，血管生成受阻，創傷癒合過程被打破或延遲，則慢性損傷(chronic wound)發展起來,最終可能導致潰瘍、截肢。 血管新生，即從已存在的毛細血管網上大量生成新生血管的過程。血管新生在創傷和外周循環閉塞情況下具有恢復血供和促進傷口癒合的積極作用。新生血管的形成受血管新生刺激因子和血管新生抑制因子的平衡調控，刺激因子包括血管內皮生長因子(vascular endothelial grow factor, VEGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growthfactor , FGF)、轉化生長因子(transforming growth factor, TGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, F1DGF)等，抑制因子包括血管抑素 angiostatin、內皮抑素 endostatin、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)等。PEDF是目前發現的活性較強的血管增生抑制因子，同時具有抑制腫瘤血管新生作用，其細胞學基礎是通過誘導激活的內皮細胞凋亡。最近研究報導PEDF在I型、II型糖尿病和代謝綜合症病人血中顯著上調；我們的預實驗結果發現高脂誘導的胰島素抵抗小鼠血清PEDF明顯高於正常飲食對照組。糖尿病升高的PEDF可能誘導微血管內皮細胞凋亡，抑制糖尿病外周血管新生，從而介導其阻礙糖尿病足創傷癒合過程，阻斷PEDF具有防治糖尿病足創傷癒合障礙的潛在應用價值。

發明內容
本發明的目的在於根據現有技術中存在的不足，提供一種可以成為製備治療PEDF升高的糖尿病及代謝綜合症等的創傷癒合緩慢的潛在藥物蛋白。本發明上述方法通過以下技術方案予以實現
一種抗PEDF單克隆抗體的製備方法，是用PEDF蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經篩選克隆獲得分泌抗PEDF單克隆抗體的雜交瘤株，得到所需單克隆抗體。本發明抗PEDF單克隆抗體可以用於製備治療PEDF升高的糖尿病及代謝綜合症等的創傷癒合疾病的藥物。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果糖尿病微血管併發症(diabetic microvascular complication)是糖尿病患者致殘、致死的主要原因。越來越多的研究表明由於血管新生(angiogensis)的受抑制,糖尿病患者的局部創傷癒合(wound healing)出現障礙,研究估計15%的糖尿病患者出現糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcers),目前國內外尚無特效治療手段,每年導致72，000病人截肢。本研究首次提出PEDF單克隆抗體可以用於製備治療PEDF升高的糖尿病及代謝綜合症等的創傷癒合疾病的藥物。


圖I為本發明重組PEDF蛋白SDS-PAGE結果 圖2為純化後PEDF單抗非變性膠電泳 圖3為不同稀釋度PEDF單抗的免疫效價檢測(western blotting)；圖4為PEDF單抗檢測內源性PEDF蛋白(western blotting)；
圖5為注射PEDF蛋白及對照GST的傷口癒合率統計；
圖6為注射PEDF蛋白及對照GST的傷口癒合情況；
圖7為糖尿病組及PEDF單抗組的傷口癒合率統計；
圖8為糖尿病組及PEDF單抗組的傷口癒合情況。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。以下實施例中的方法、設備、材料，如果未特別說明，均為本領域常規的方法、設備和材料。實施例I PEDF單克隆抗體製備及鑑定 一、PEDF單克隆抗體製備
I. PEDF重組蛋白製備
選用pET30a(+)(購自Novagen)作為載體，根據人源PEDF基因序列設計引物，PCR擴增PEDF基因的cDNA，選用EcoRI和HindIII限制性內切酶(購自Takara)酶切純化後的PEDF cDNA，與經過同樣酶切的pET30a(+)連接，得到連接產物pET30a(+)-PEDF。將pET30a(+)-PEDF質粒轉化大腸桿菌BL-21 DE3，經IPTG誘導後收集細菌，用Bindingbuffer重懸,超聲離心後獲得可溶性重組蛋白。再將蛋白與Ni-NTA樹脂(購自Novagen)4°C充分結合,之後上柱,用Washing buffer洗去雜蛋白，最後用Elution buffer將蛋白洗脫下來，再經過SDS-PAGE鑑定作為免疫源(見圖1)，最終獲得的PEDF蛋白濃度3. 3mg/ml,純度>98%，蛋白得率>15mg/L。2.動物免疫
採用5隻6-8周齡的雌性BALB/C純系小鼠，並通過標準程序加強免疫，共4次免疫，從第二次開始ELSA檢測效價，在正常狀態，第四次最終免疫，並通過ELISA的結果選出最佳免疫應答的兩隻小鼠。3.雜交瘤細胞融合篩選
將最佳免疫應答的兩隻小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，得到的雜交瘤細胞通過增殖和ELISA篩選得到高效價的克隆，通過有限稀釋法對2-5個陽性母細胞進行亞克隆並鑑定亞類，最終獲得6個細胞株，每個細胞株有2個亞克隆。4.單克隆抗體的生產及純化
I) ELISA法和Western blot檢測細胞培養上清的免疫效價和特異性(見表1)，選擇進一步用於免疫小鼠的細胞株2D9F10。表I
權利要求
1.一種抗PEDF單克隆抗體，其特徵在於所述單克隆抗體的製備方法是用PEDF蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經篩選克隆獲得分泌抗PEDF單克隆抗體的雜交瘤株，得到所需單克隆抗體。
2.權利要求I所述抗PEDF單克隆抗體在製備治療PEDF升高的創傷癒合疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗PEDF單克隆抗體及其製備方法和應用。本發明所述抗PEDF單克隆抗體的製備方法是用PEDF蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經篩選克隆獲得分泌抗PEDF單克隆抗體的雜交瘤株，得到所需單克隆抗體。本發明單克隆抗體可以用於製備治療PEDF升高的創傷癒合疾病的藥物。
文檔編號A61P17/02GK102757497SQ20121024512
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月16日 優先權日2012年7月16日
發明者戴智育, 楊霞, 高國全, 齊煒煒 申請人:中山大學