利用紅和遠紅螢光染料在細胞級表徵生物組織的製作方法

2023-06-28 05:21:36 1

利用紅和遠紅螢光染料在細胞級表徵生物組織的製作方法
【專利摘要】在至少一個方面，本文公開的實施例涉及觀察生物組織形態的方法，其包括：-在所述生物組織上使用螢光染料，其中所述螢光染料選自專利藍V、異硫藍、甲苯胺藍、金絲桃素、吲哚氰綠、MVAC、或亞德裡亞黴素；-使用顯微線性或非線性成像系統來形成所述生物組織的圖像，其中所述染料的螢光在細胞級揭示了所述組織的形態。
【專利說明】利用紅和遠紅螢光染料在細胞級表徵生物組織

【背景技術】
[0001] 口腔癌（包括嘴唇、舌部、咽喉和口腔）在所有的癌症形式中排列第12位。儘管 原發惡性腫瘤當前在治療上有所進展，但由於其確診時通常已是晚期，因而仍然是一種預 後不佳的癌症。白光檢查和觸診通常用於定位活體檢視部位。在進行了放射性膠體和藍色 染料的間質注射後，術中淋巴造影已被確認和廣泛接受為常規的手術程序，其主要用於乳 腺癌、皮膚黑色素瘤以及較小範圍的頭頸癌。
[0002] 已引入光學診斷方法來改善對癌症前期及癌性損害與正常組織之間的鑑別， 以及用來檢測前哨淋巴結（Rasmussen J.C.et al.，"Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence", Curr Opin Biotechno 2009;20:74-822009,以及 Varghese P. et al. , ''Methylene Blue Dye_A Safe and Effective Alternative for Sentinel Lymph Node Localization",The Breast J 2008;14:61-7)。已利用來自內源 性和外源性誘導螢光團的宏觀（或稱可目視）螢光成像，或利用諸如喇曼光譜學、螢光光譜 學和彈性散射光譜學等的分光鏡分析法進行臨床研究。共焦顯微術長時間局限於基礎研 究，但是近年來已用於可疑組織細胞級的體內成像（Kiesslich R.et al.，〃Confocal laser endoscopy for diagnosing intraepithelial neoplasias and colorectal cancer in vivo〃, Gastroenterology2004 ; 127:706-13)。為了滿足對高解析度成像的需要，過去幾年 已廣泛使用基於探頭的共焦雷射顯微內鏡（pCLE)。這樣的非侵入式方案被稱為"光學活體 檢視"，其使得利用螢光染料來評定和監視各種器官中的癌症及其他疾病成為可能。
[0003] 金絲桃素，一種輕基化二苯基二萘嵌苯喹啉（phenantroperylenequinone),已 被考慮用來進行螢光診斷。已評價了這種染料在異常細胞特別是癌性細胞中較高的上染 率對於提高膀胱癌檢出率（D'Hallewin M-A.et al.，〃Hypericin_based fluorescence diagnosis of bladder carcinoma〃，BJU International 2〇〇2;89:76〇_3)和惡性口腔損 害檢出率（Thong P. S. P. et al.，''Clinical application of fluorescence endoscopic imaging using hypericin for the diagnosis of human oral cavity lesions"，Br J Cancer 2009;101:1580-4)的可能性。在後來的研究中，診斷標準是基於紅藍強度比，在非 惡性損害中的紅藍強度比大於惡性損害中的紅藍強度比。
[0004] 甲苯胺藍，一種來自噻嗪族的公知異染性染料，現已研究了其在口腔寬場檢查中 的可能性，通過某種局部施用對惡性和惡變前的損害進行染色：根據愛潑斯坦（Epstein) 所述，利用這種處理方法，具有較高風險發展成癌症的惡變前損害會被優先著色。利用這種 活體染料進行宏觀檢查時，主要的假陽性結果通常與炎症或創傷區域有關。因此，為了消除 這些因素，強烈推薦在兩星期後進行複查（Epstein J. B. et al.，2009)。一種現有的元分析 法被用來評價甲苯胺藍在口腔癌篩查中的有效性。結果表明，在高風險人群中，該方案的靈 敏度範圍在93. 5%至97. 5%之間，特異性範圍在73. 3%至92. 9%之間。
[0005] 為了突出用接觸式內鏡檢查術進行檢查的細胞結構，已考慮用亞甲基藍（一種與 甲苯胺藍密切相關的噻嗪染料）對口部和喉部上皮的表面層進行染色。可對核質比例以及 細胞核顏色、大小和形狀進行原位分析，然而儘管其具有作為診斷工具的潛在價值，但是近 年來幾乎沒有什麼研究描述這種技術的應用。
[0006] 裡亞茲（Riaz)提出了，在口腔中進行了局部施用後，可利用亞甲基藍優先染色 癌症前期和癌性損害的能力（Riaz et al.，"Methylene blue as an early diagnostic marker for oral precancer and cancer"，SpringerPlus 2013,2:95)。一項對 120 名病 人的試驗性研究表明，這種宏觀方法的靈敏度為91. 4%，特異性為66. 6%，且陽性預測值 為97. 7%，陰性預測值為33%。出現假陽性的原因可能在於炎症性和非正常損害。這一方 法已被推薦用於高風險人群的大規模口部篩查。
[0007] 最後，專利藍V(-種來自三芳基甲烷族染料的活體藍色染料）在臨床實踐中被 主要用來進行前哨淋巴結造影。在歐洲主要使用專利藍。其對應的異構體，異硫藍，已在 美國被食品藥品監督管理局批准。在進行間質注射後，兩種染料的較低濃度就足以宏觀 地顯現出染成藍色的淋巴結及其輸入淋巴管。在各種臨床研究中已用鈉螢光素和吲哚氰 綠描述了用於前哨淋巴結檢測的宏觀突光（X*an A.G.et al.，〃l%Lymphazurin vs 10% Fluorescein for Sentinel Node Mapping in Colorectal Tumors"，Arch Surg 2004 ； 139:1180-4)。
[0008] 甲苯胺藍、亞甲基藍、專利藍、吲哚氰綠和金絲桃素是當前在臨床實踐或臨 床試驗中用於診斷程序宏觀指導的染料，且它們對病人的副作用極小（Narui K.et al.，''Observational study of blue dye-assisted four-node sampling for axillary staging in early breast cancer"，Eur J Surg Oncol 2010;36:731-6)。
[0009] 在本公開中，為了表徵正常和癌性頭頸組織，以及在細胞級上進行淋巴結成像，我 們首次評估了單獨或組合使用紅螢光染料金絲桃素，以及遠紅甲苯胺藍（TB)、專利藍（PB) 染色劑和紅外吲哚氰綠（ICG)染色劑的螢光屬性。對人類手術樣品和大鼠淋巴結進行高分 辨率螢光成像是利用膝上型共焦雷射掃描顯微鏡（CLSM)、非線性（多光子）顯微鏡和基於 探頭的共焦雷射內鏡（PCLE)實現的。然後，我們將對應的共焦及非線性圖像與利用標準的 組織病理學方法獲得的結果進行了比較。此外，還討論了一種可能的結合共焦顯微術、反射 和螢光信息的多模式方案，以便改善活體檢視及前哨淋巴結部位的定位。


【發明內容】

[0010] 在至少一個方面，本文公開的實施例涉及觀察生物組織形態的方法，其包括：
[0011] -在所述生物組織上使用螢光染料，其中所述螢光染料選自專利藍V、異硫藍、甲 苯胺藍、金絲桃素、吲哚氰綠、MVAC、或亞德裡亞黴素；
[0012] -使用顯微線性或非線性成像系統來形成所述生物組織的圖像，其中所述染料的 螢光在細胞級揭示了所述組織的形態。
[0013] 申請人:在本公開中示出了，上述染料的未知屬性，或者未知螢光屬性（例如：專利 藍V、異硫藍），或者在細胞級揭示對比圖像的未知能力（例如：金絲桃素、MVAC、亞德裡亞 黴素、吲哚氰綠）。
[0014] 更具體地，本公開示出了專利藍V、用於原位加亮前哨淋巴結細胞結構的吲哚氰 綠、以及更廣泛地，所有螢光染料；金絲桃素、甲苯胺藍、專利藍V、吲哚氰綠，在局部施用 後，提供了有關惡性頭頸損害的形態信息。
[0015] MVAC和亞德裡亞黴素用於在細胞級進行"治療成像"，允許精確施用和監視藥物的 體內分解，以及更好地理解這一方案的體內分子治療效能。
[0016] 根據一實施例，所述方法包括通過按染料濃度引入螢光染料，以滿足特定的細胞 檢查條件，其中所述染料濃度顯著低於傳統用於通行臨床用途的染料濃度。在這些新條件 下，獲得一種可接受的對比，其允許病理學家對組織執行細胞級的形態記錄，這種記錄允許 識別關鍵參數和細胞結構，以支持診斷。
[0017] 根據一實施例，所述方法包括將專利藍引入所述生物組織，其中專利藍的濃度根 據處理途徑的不同在〇? 05mg/mL(0. 005% )至25mg/mL(2. 5% )之間選擇。
[0018] 根據一實施例，所述方法包括將甲苯胺藍引入所述生物組織，其中甲苯胺藍的濃 度在 0? lmg/mL(0. 01% )至 2〇mg/mL(2% )之間選擇。
[0019] 根據一實施例，所述方法包括將金絲桃素引入所述生物組織，其中金絲桃素的濃 度在 0? 252 i! g/mL(0. 5 i! M)至 5. 02 i! g/mL(10 i! M)之間選擇。
[0020] 根據一實施例，所述方法包括將吲哚氰綠引入所述生物組織，其中吲哚氰綠的濃 度根據處理途徑的不同在0. 05mg/ml至5mg/ml之間選擇。
[0021] 根據一實施例，所述螢光是通過體外線性或非線性顯微術觀察的。
[0022] 根據一實施例，所述螢光是通過體內線性或非線性顯微術觀察的。
[0023] 根據不同的實施例，所述螢光染料的引入是通過靜脈施用、或者皮下施用、或者通 過黏膜下或局部施用進行的。
[0024] 根據不同的實施例，所述生物組織選自腹骨盆腔、胸腔、頭頸區域、淋巴系統。
[0025] 根據一實施例，顯微術是通過基於光纖的顯微內鏡執行的。
[0026] 下表以非限制性方式概括了這些染料在顯微內鏡中的可能用途：
[0027]

【權利要求】
1. 一種用於觀察生物組織形態的方法，包括： -在所述組織上使用螢光染料，其中所述螢光染料選自專利藍V、異硫藍、甲苯胺藍、金 絲桃素、吲哚氰綠、MVAC、或亞德裡亞黴素； _使用顯微成像系統來形成所述生物組織的圖像，其中所述染料的螢光在細胞級揭示 了所述組織的形態。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述螢光染料為專利藍。
3. 根據權利要求2所述的方法，進一步包括將專利藍引入所述組織，其中專利藍的濃 度在0. 005%至2. 5%之間選擇。
4. 根據權利要求1所述的方法，其中所述螢光染料為甲苯胺藍。
5. 根據權利要求4所述的方法，進一步包括將甲苯胺藍引入所述組織，其中甲苯胺藍 的濃度在〇. 1 %至2 %之間選擇。
6. 根據權利要求1所述的方法，其中所述螢光染料為金絲桃素。
7. 根據權利要求6所述的方法，進一步包括將金絲桃素引入所述組織，其中金絲桃素 的濃度在〇. 5 ii M至10 ii M之間選擇。
8. 根據權利要求1所述的方法，其中所述螢光染料為吲哚氰綠。
9. 根據權利要求6所述的方法，進一步包括將吲哚氰綠引入所述組織，其中吲哚氰綠 的濃度根據施用途徑的不同在〇. 〇5mg/ml至2. 5mg/ml之間選擇。
10. 根據權利要求1至9任一項所述的方法，其中所述螢光是通過體外顯微術觀察的。
11. 根據權利要求1至9任一項所述的方法，其中所述螢光是通過體內顯微術觀察的。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中顯微術是通過基於光纖的顯微內鏡執行的。
13. 根據權利要求10或11任一項所述的方法，其中顯微術是通過非線性顯微術執行 的。
14. 根據權利要求1至13任一項所述的方法，包括將所述螢光染料引入所述組織，其中 所述染料為吲哚氰綠，且所述染料的施用是通過靜脈施用完成的。
15. 根據權利要求1至13任一項所述的方法，包括將所述螢光染料引入所述組織，其中 所述染料選自專利藍和吲哚氰綠，且所述染料的施用是通過皮下施用完成的。
16. 根據權利要求1至13任一項所述的方法，包括將所述螢光染料引入所述組織，其中 所述染料選自專利藍和吲哚氰綠，且所述染料的施用是通過黏膜下途徑完成的。
17. 根據權利要求1至13任一項所述的方法，其中所述染料是通過局部途徑施用的。
【文檔編號】G01N21/64GK104350376SQ201380025844
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年5月17日 優先權日:2012年5月18日
【發明者】繆麗爾·阿巴西, 奧迪勒·卡西拉吉, 科琳娜·拉普拉斯-比埃 申請人:古斯塔夫·魯西Igr研究所, 冒納凱阿技術公司