一種萬古黴素菌株及其發酵產萬古黴素的方法與流程
2023-06-28 07:12:36 1
本發明涉及產萬古黴素的技術領域，尤其涉及一種萬古黴素菌株及其發酵產萬古黴素的方法。
背景技術：
萬古黴素是由McCormick等(McCormick MH，Stark WM，Plttenger GE，et al.Vancomycin，a new antibiotic[J].Chemical and biological properties，1955-1956，23：601-611)於1956年從印度尼西亞土壤中選育到的一株被稱為東方擬無枝酸菌Amycolatopsis orientalis的發酵液中分離得到的具有抗革蘭氏陽性菌的一種糖肽類抗生素。萬古黴素問世後的20年，由於青黴素和頭孢菌素類抗生素的上市使用及其很強的耳腎毒性，它僅作為保留藥物，用於治療由少數耐藥性金黃色葡萄球菌引起的嚴重感染性疾病，臨床使用很少。後來隨著β-內醯胺類抗生素的大量使用，由甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)所引起的感染逐漸流行。1998～2000年間，MRSA佔金黃色葡萄球菌的比例高達30％以上。在這種情況下，萬古黴素愈來愈受人們的重視，成為目前臨床上用於治療由MRSA引起的嚴重感染疾病的首選藥物(RimakrishnanI N.Antibacterial activities and modes of action of vancomycin and relatedglycopeptides[J].Antimicrobical agents chem，並被國際抗生素專家譽為「人類對付頑固性耐藥菌株的最後一道防線」和「王牌抗生素」。由於萬古黴素作用機制獨特，而且在體內易分解，使其不 僅在臨床上，而且在畜牧等行業上也得到了廣泛的應用。
目前萬古黴素的生產主要採用培養生產萬古黴素的東方擬無枝酸菌Amycolatopsisorientalis的方法獲得，但菌株生產能力有限。研究人員通過各種手段對菌株進行分離、選育或突變，獲得了一些萬古黴素生產菌株，但耗時耗力。核糖體突變選育的方法通過引入某些抗生素對菌體核糖體蛋白合成的相關基因進行刺激，使得抗生素基因超量表達，從而提高菌株生產能力，是一種簡單有效的菌株誘變選育方法。發現將鏈黴素抗性引入野生的d藍色鏈黴菌，可以使放線菌紫紅素產量提高10倍，利用聯合誘變先後引入d藍色鏈黴菌，使得放線菌紅素產量最大提高了48倍。將這一技術應用於Bacillus屬和Pseudomonas屬，使其抗生素產量提高5～50倍。
技術實現要素：
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種萬古黴素菌株及其發酵產萬古黴素的方法。
本發明的技術方案如下：本發明提供一種萬古黴素菌株及其發酵產萬古黴素的方法，包括以下步驟：
a、將萬古黴素生產菌株進行液體發酵培養基培養，液體發酵種子培養基組成為酵母粉3～6g/L，麥芽提取物3～5g/L，蛋白腖10～15g/L，葡萄糖15～20g/L，pH為6.8；種子培養條件為：28～30℃，裝液量40/250mL，搖床轉速150～220rpm，培養24～48h；液體發酵培養基組成為糊精100～150g/L，土豆蛋白15～25g/L，黃豆粉15～25g/L，磷酸氫二鉀0.1～0.5g/L， 消沫劑1～3g/L，氯化鈉1.2～1.6g/L，pH 6.8～7.2，培養條件為28～30℃，裝液量40/250mL，搖床轉速150～220rpm，培養90～130h，所得溶液為含淨抗生素活性洗脫液；
b、在沉澱容器中沉澱步驟a中所得的含淨抗生素活性洗脫液，得到晶體漿料，並且攪拌該晶體漿料，將PH值連續調節至所需程度，直至完全沉澱，得到晶體沉澱物；
c、將步驟b得到的晶體沉澱物溶解為水溶液，然後通過陰離子交換樹脂將其轉為萬古黴素。
本發明優選的，根據步驟b中，通過在含淨抗生素活性洗脫液中加入與水互溶的有機溶劑來結晶，結晶前溶液中萬古黴素含量為5.0％～30.0％。
本發明優選的，所述機溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮。
本發明優選的，所述機溶劑加入量為：甲醇為2～6倍結晶液體積；乙醇為1.5～5.5倍結晶液體積；異丙醇為1.2～5倍結晶液體積；丙酮為1.0～4.5倍結晶液體積。
本發明優選的，根據步驟b中，結晶過程起始溫度為25～60℃；結晶過程終點溫度為0～30℃；結晶過程降溫速度為0.5～5℃/分鐘。
本發明優選的，根據步驟c中，晶體用水溶解後的萬古黴素濃度為1.0％～20.0％。
本發明優選的，根據步驟c中，所述陰離子交換樹脂為717樹脂、D293樹脂或D301FD樹脂。
本發明優選的，所述陰離子交換樹脂用量按製備1克萬古黴素需要用2～10mL的陰離子交換樹脂計。
本發明的有益效果如下：
採用上述方案，本發明採用核糖體誘變選育的手段進行萬古黴素生產 菌株選育，獲得一株東方擬無枝酸菌Amycolatopsis orientalis萬古黴素生產菌株，該菌株萬古黴素的生產能力比出發菌株提高了7.12倍，高達8.9g/L。且經過傳代穩定性研究，連續傳代5次後萬古黴素產量穩定性高達92.7％。
附圖說明
圖1為本發明所述一種萬古黴素菌株及其發酵產萬古黴素的方法的流程圖。
具體實施方式
以下結合附圖和具體實施例，對本發明進行詳細說明。
請參閱圖1，本發明提供一種萬古黴素菌株及其發酵產萬古黴素的方法，包括以下步驟：
a、將萬古黴素生產菌株進行液體發酵培養基培養，液體發酵種子培養基組成為酵母粉3～6g/L，麥芽提取物3～5g/L，蛋白腖10～15g/L，葡萄糖15～20g/L，pH為6.8；種子培養條件為：28～30℃，裝液量40/250mL，搖床轉速150～220rpm，培養24～48h；液體發酵培養基組成為糊精100～150g/L，土豆蛋白15～25g/L，黃豆粉15～25g/L，磷酸氫二鉀0.1～0.5g/L，消沫劑1～3g/L，氯化鈉1.2～1.6g/L，pH 6.8～7.2，培養條件為28～30℃，裝液量40/250mL，搖床轉速150～220rpm，培養90～130h，所得溶液為含淨抗生素活性洗脫液；
b、在沉澱容器中沉澱步驟a中所得的含淨抗生素活性洗脫液，得到晶體漿料，並且攪拌該晶體漿料，將PH值連續調節至所需程度，直至完全沉澱，得到晶體沉澱物；
c、將步驟b得到的晶體沉澱物溶解為水溶液，然後通過陰離子交換樹脂將其轉為萬古黴素。
根據步驟b中，通過在含淨抗生素活性洗脫液中加入與水互溶的有機溶劑來結晶，結晶前溶液中萬古黴素含量為5.0％～30.0％。
所述機溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮。
所述機溶劑加入量為：甲醇為2～6倍結晶液體積；乙醇為1.5～5.5倍結晶液體積；異丙醇為1.2～5倍結晶液體積；丙酮為1.0～4.5倍結晶液體積。
根據步驟b中，結晶過程起始溫度為25～60℃；結晶過程終點溫度為0～30℃；結晶過程降溫速度為0.5～5℃/分鐘。
根據步驟c中，晶體用水溶解後的萬古黴素濃度為1.0％～20.0％。
根據步驟c中，所述陰離子交換樹脂為717樹脂、D293樹脂或D301FD樹脂。
所述陰離子交換樹脂用量按製備1克萬古黴素需要用2～10mL的陰離子交換樹脂計。
實施例：
本發明包括以下步驟：
a、將萬古黴素生產菌株進行液體發酵培養基培養，液體發酵種子培養基組成為酵母粉4g/L，麥芽提取物5g/L，蛋白腖12g/L，葡萄糖18g/L，pH為6.8；種子培養條件為：30℃，裝液量189mL，搖床轉速187rpm，培養48h；液體發酵培養基組成為糊精150g/L，土豆蛋白25g/L，黃豆粉25g/L，磷酸氫二鉀0.4g/L，消沫劑2g/L，氯化鈉1.3g/L，pH 7.2，培養條件為28℃，裝液量245mL，搖床轉速220rpm，培養110h，所得溶液為含淨抗生素活性 洗脫液；
b、在沉澱容器中沉澱步驟a中所得的含淨抗生素活性洗脫液，得到晶體漿料，並且攪拌該晶體漿料，將PH值連續調節至所需程度，直至完全沉澱，得到晶體沉澱物，通過在含淨抗生素活性洗脫液中加入與水互溶的有機溶劑來結晶，結晶前溶液中萬古黴素含量為30.0％，所述機溶劑為甲醇，所述機溶劑加入量為：甲醇為5倍結晶液體積，結晶過程起始溫度為45℃；結晶過程終點溫度為26℃；結晶過程降溫速度為4℃/分鐘；
c、將步驟b得到的晶體沉澱物溶解為水溶液，然後通過陰離子交換樹脂將其轉為萬古黴素，晶體用水溶解後的萬古黴素濃度為20.0％，所述陰離子交換樹脂為D293樹脂，所述陰離子交換樹脂用量按製備1克萬古黴素需要用7mL的陰離子交換樹脂計。
綜上所述，採用上述方案，本發明採用核糖體誘變選育的手段進行萬古黴素生產菌株選育，獲得一株東方擬無枝酸菌Amycolatopsis orientalis萬古黴素生產菌株，該菌株萬古黴素的生產能力比出發菌株提高了7.12倍，高達8.9g/L。且經過傳代穩定性研究，連續傳代5次後萬古黴素產量穩定性高達92.7％。
以上僅為本發明的較佳實施例而已，並不用於限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。