中國葡萄屬野生種秋葡萄抗黑痘病候選基因序列及應用的製作方法

2023-06-28 00:05:06

專利名稱：中國葡萄屬野生種秋葡萄抗黑痘病候選基因序列及應用的製作方法
技術領域：
本發明明涉及葡萄常規雜交育種、分子標記輔助育種、基因定位與作圖的方法與技術，特別涉及中國葡萄屬野生種秋葡萄抗黑痘病候選基因序列及其應用。
背景技術：
葡萄黑痘病(Elsinoe ampelina(de bary)shear)原產歐洲和北非，是危害歐洲葡萄的重要真菌病害之一。目前，對於黑痘病的防治，主要以化學防治為主，但是，化學防治不僅增加生產成本，造成環境汙染，還可能引起葡萄病害生理小種的變異及病原菌的抗藥性，同時降低葡萄及其加工產品(葡萄酒、葡萄乾等)的產量和品質。科學研究和生產實踐證明，利用植物自身抗病性，培育抗病、優質葡萄新品種是最經濟有效的措施之一。中國是葡萄屬植物重要的起源地之一，我國的野生葡萄資源不僅抗病，而且和歐洲葡萄雜交親和性好，可以有效地將抗病基因與歐洲葡萄品質性狀相結合，引入中國野生葡萄抗病基因育種，不僅受到國內研究者，而且受到國外學者的高度重視，所以中國野生葡萄是迄今公認的抗病育種種質資源，因而利用中國野生葡萄對黑痘病的抗性基因與歐洲葡萄品種優良品質基因有效地結合，培育優良抗病葡萄新品種和創造新型葡萄種質既是生產實踐中急需解決的實際問題也是葡萄育種家面臨的重要任務。
植物能對特定的病原微生物進行識別並產生抗性，這是由抗病基因決定的。基因對基因假說認為，抗病基因是病原微生物致病基因的受體，能與致病因子複合物通過一系列信號傳導起始抗病反應，如發生過敏性反應、細胞壁增厚、壞死斑的出現以及防衛基因的表達等。抗病基因根據編碼的蛋白質結構上的異同，可以將除Hm1外的其他基因分為4大類，即含有核苷酸結合位點(NBS)和富含亮氨酸重複(LRR)的胞內受體蛋白基因；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STK)基因；含有胞外LRR結構的跨膜受體蛋白基因以及同時含有胞外LRR和胞內STK結構的跨膜受體蛋白基因，這些不同植物來源的抗病基因在結構上的保守性暗示了利用同源序列法分離抗病基因的潛在可能性。而基於同源序列的基因分離方法目前已逐漸受到重視，其中小麥抗葉銹病基因Lr10的分離是利用同源序列法進行抗病基因分離的首次成功報導。

發明內容
本發明的目的在於，提供中國葡萄屬野生種秋葡萄抗黑痘病候選基因基因序列及其應用。
本發明是在對中國葡萄屬野生種進行抗病性鑑定，獲得秋葡萄(V.romanetii Roman)抗病種質的基礎上，採用同源序列克隆法分離葡萄抗黑痘病候選基因片段，進行序列同源性分析，為進一步利用cDNA末端快速擴增技術獲得抗病基因全長序列奠定基礎。
為了實現上述目的，本發明首次採用抗病基因同源序列技術進行中國葡萄屬野生種抗黑痘病(Elsinoe ampelina(de bary)shear)候選基因克隆，獲得了抗黑痘病候選基因DNA片段2個，其大小介於507bp～510bp之間。以該核苷酸序列為基礎，可以進行抗黑痘病基因標記輔助育種，用作葡萄育種中檢測葡萄抗黑痘病基因的探針；可以根據這些片段在中國野生葡萄與歐洲葡萄雜種後代中的分離情況，進行中國野生葡萄抗黑痘病基因定位與作圖。


圖1是中國葡萄屬野生種秋葡萄平利-7(3)抗黑痘病候選基因序列；圖2是中國葡萄屬野生種秋葡萄平利-7(4)抗黑痘病候選基因序列。
以下結合附圖和發明人給出的實施例對本發明作進一步詳細說明。
具體實施例方式
本發明獲得的中國葡萄屬野生種秋葡萄平利-7抗黑痘病候選基因序列具體操作步驟如下A.採用改進的CTAB法(西北植物學報，王西平等，2003，23(3)473-476)提取中國葡萄屬野生種秋葡萄平利-7葉片基因組DNA。
B.根據抗病基因N、L6及RPS2位於P-環(P-loop)上的GVGKTT，及位於基因弱疏水區上的GLPLAL保守結構域設計簡併PCR引物5『GGDGTD GGN AAR ACW AC 3』與5『CAA CGC TAG TGG CAA TCC 3』，引物由大連Takara公司合成。在25μl PCR反應體積中加入PCR buffer(含Mg2+)2.5μl，dNTP 0.5μl，模板DNA 100ng，引物1 1.5μl，引物2 1.5μl，TaqDNA聚合酶1U(5U/μl)，用雙蒸水補被齊體積至25μl，加入25.0μl礦物油。PCR擴增程序為94℃ 2min，94℃ 1min；50℃ 1min，72℃ 2min共35個循環；72℃，10min。取反應產物6.0μl跑1.5％瓊脂糖凝膠電泳(5V·cm-1)約40min，獲得了一條長度約為500bp的DNA特異帶。
C.用DNA膠回收試劑盒將獲得的一條約500bp左右的DAN條帶回收，連接pGEM-T easy載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含有Amp(100μg·ml-1)和X-gal/IPTG的LB平板上培養，藍、白斑篩選鑑定挑選白色菌落培養。用UNIQ-10柱式質粒小量抽提試劑盒回收質粒，用EcoR I酶切鑑定有外源DNA片段插入的陽性克隆。將陽性克隆送大連寶生生物公司測序，測序結果表明，獲得秋葡萄DNA特異片段2個，大小為507bp、510bp(圖1-圖2)。
以下是發明人給出的實施例，但本發明不局限於這些實施例。
實施例1以保存於西北農林科技大學葡萄種質資源圃已進行抗黑痘病鑑定的中國野生葡萄秋葡萄(賀普超等，中國農業科學，1991；Wang Y et al，HortScience，1998；Wang Y et al，Vitis，1995)與歐洲葡萄品麗珠、加利釀的種間雜交後代452株為試材，採用改良的CTAB法提取基因組DNA，根據獲得的抗黑痘病候選基因序列設計特異引物，進行PCR擴增，據特異DNA片段在雜種材料中的表現情況，對照上述葡萄材料的抗黑痘病田間鑑定結果，獲得與葡萄抗黑痘病基因緊密連鎖的DNA片段和抗黑痘病基因DNA片段。
實施例2用保存於西北農林科技大學葡萄種質資源圃的中國葡萄屬野生種秋葡萄平利-7、留壩-11(賀普超等，中國農業科學，1991；Wang Y et al，HortScience，1998；Wang Y et al，Vitis，1995)與歐洲葡萄優良品種黑比諾、無核白雜交，獲得抗黑痘病雜種植株。採用改良的CTAB法提取上述葡萄材料基因組DNA，根據實施例1獲得的與抗黑痘病基因緊密連鎖的DNA片段設計引物，對上述葡萄材料基因組DNA進行PCR擴增，凡擴增產物出現DNA特異片段的雜種材料，為抗黑痘病雜種植株，或者是抗黑痘病基因的攜帶者，這些可以用做進一步抗病品種選育的材料和育種種質。
實施例3採用田間自然鑑定、田間接種鑑定對實施例2的葡萄雜種材料進行抗黑痘病鑑定，獲得抗病雜種與感病雜種。據實施例2獲得的與抗黑病基因緊密連鎖的DNA片段設計的引物，對上述葡萄雜種材料進行PCR擴增，據DNA片段在雜種中的擴增與分離情況，結合田間鑑定結果，利用MAPMAKER軟體進行抗秋葡萄抗黑痘病基因定位與作圖，獲得抗病基因連鎖圖譜，為進一步通過圖譜克隆分離抗黑痘病基因鑑定基礎。
基因序列中國葡萄屬野生種秋葡萄(V.romanetii Roman)平利-7(3)抗黑痘病候選基因序列1GGTGTAGGGA AGACAACACT CGCACGGCTG CTTTACAACA ATGACATGGC CAAAAACTTT61 AACCTAAAAG CATAGGTTTG TGTGTCTGAT GTGTTTGATG TGGAAAATAT AACAAAAGCA121 ATTTTCAATT CGGTGGTAAG TTCTGATGCA GGTGGCTCGT TCCAATAGGT TCAAAAGAAA181 TTGACAGAGG CATTGATAGG GAAAAAGTTT TTACTCATTC TAAACGATGT ATGGAACCAA241 GATTATGGTA GTTGGGATAG CTTGCGCCCT CCTTTTATTG GAGGTACAAA AGGAAGCAAA301 GTCATAGTCA CAACACGCAA TAAAAACGTT GCATTGATGA TGGGAGCTGA GGAGAAGGTT361 TATGAACTAA AAACTTTATC AGAAGATGCT TGTTGGTCGA TGTTTAAGAA GCATGTGTTT421 GAACATAGAA ATATTGACGA TCATCCAAAC CTAGTGTCTA TTGGTAGGAA ATTTGTTAGC481 AAGTGTGGTG GATTGCCACT AGCGTTG中國葡萄屬野生種秋葡萄(V.romanetii Roman)平利-7(4)抗黑痘病候選基因序列1GGAGTTGGTA AAACTACCCT CTTGCGGAAA ATCAATAATG AGTATTTTGG TAAAAGTAAC61 GATTTTGATG TGGTGATATG GGTAGTGGTG TCGAAACCAA TCAGTATAGA AAAAATTCAA121 GAAGTGATTC TGAAGAAATT ATCTACCCCA GAGCACAACT GGAAGAGTAG TAGCAAGGAG181 GAGAAGACTG CAGAAATATT CAAGTTGTTG AAAGCCAAAA ACTTTGTGAT ATTGCTTGAT241 GATATGTGGG AGCGACTCGA TCTCTTGGAG GTGGGGATAC CTGATTTGAG TGATCAAACG301 AAGTCCAGAG TAGTACTCAC TACGAGATCT GAACGAGTAT GCGATGAAAT GGAAGTTCAT361 AGGAGGATGA GGGTAGAGTG TTTGACACCG GATGAAGCAT TTTCTCTGTT CTGTGATAAG421 GTTGGTGAGA ATATCCTGAA TTCACATCCG GATATAAAAA GGCTTGCTAA GATTGTTGTT481 GAAGAATGTA GAGGATTGCC ACTAGCGTTG
權利要求
1.中國葡萄屬野生種秋葡萄抗黑痘病候選基因序列，其特徵在於，包括中國葡萄屬野生種秋葡萄平利-7的2個抗黑痘病候選基因序列，這些抗黑痘病候選基因序列是中國葡萄屬野生種秋葡萄平利-7(3)抗黑痘病候選基因序列1GGTGTAGGGA AGACAACACT CGCACGGCTG CTTTACAACA ATGACATGGC CAAAAACTTT61 AACCTAAAAG CATAGGTTTG TGTGTCTGAT GTGTTTGATG TGGAAAATAT AACAAAAGCA121 ATTTTCAATT CGGTGGTAAG TTCTGATGCA GGTGGCTCGT TCCAATAGGT TCAAAAGAAA181 TTGACAGAGG CATTGATAGG GAAAAAGTTT TTACTCATTC TAAACGATGT ATGGAACCAA241 GATTATGGTA GTTGGGATAG CTTGCGCCCT CCTTTTATTG GAGGTACAAA AGGAAGCAAA301 GTCATAGTCA CAACACGCAA TAAAAACGTT GCATTGATGA TGGGAGCTGA GGAGAAGGTT361 TATGAACTAA AAACTTTATC AGAAGATGCT TGTTGGTCGA TGTTTAAGAA GCATGTGTTT421 GAACATAGAA ATATTGACGA TCATCCAAAC CTAGTGTCTA TTGGTAGGAA ATTTGTTAGC481 AAGTGTGGTG GATTGCCACT AGCGTTG中國葡萄屬野生種秋葡萄平利-7(4)抗黑痘病候選基因序列1GGAGTTGGTA AAACTACCCT CTTGCGGAAA ATCAATAATG AGTATTTTGG TAAAAGTAAC61 GATTTTGATG TGGTGATATG GGTAGTGGTG TCGAAACCAA TCAGTATAGA AAAAATTCAA121 GAAGTGATTC TGAAGAAATT ATCTACCCCA GAGCACAACT GGAAGAGTAG TAGCAAGGAG181 GAGAAGACTG CAGAAATATT CAAGTTGTTG AAAGCCAAAA ACTTTGTGAT ATTGCTTGAT241 GATATGTGGG AGCGACTCGA TCTCTTGGAG GTGGGGATAC CTGATTTGAG TGATCAAACG301 AAGTCCAGAG TAGTACTCAC TACGAGATCT GAACGAGTAT GCGATGAAAT GGAAGTTCAT361 AGGAGGATGA GGGTAGAGTG TTTGACACCG GATGAAGCAT TTTCTCTGTT CTGTGATAAG421 GTTGGTGAGA ATATCCTGAA TTCACATCCG GATATAAAAA GGCTTGCTAA GATTGTTGTT481 GAAGAATGTA GAGGATTGCC ACTAGCGTTG。
2.中國葡萄屬野生種秋葡萄抗黑痘病候選基因序列，包括中國葡萄屬野生種秋葡萄平利-7(3)、平利-7(4)的2個抗黑痘病候選基因序列，在進行抗黑痘病標記輔助育種，用作葡萄育種中檢測葡萄抗黑痘病基因的探針，及其根據這些片段在中國野生葡萄與歐洲葡萄雜交後代中的分離情況，進行抗黑痘病基因定位與作圖的應用。
全文摘要
本發明涉及葡萄常規雜交育種、分子標記輔助育種、基因定位與作圖的方法與技術。本發明採用抗病基因同源序列法(Resistant geneanalogus，RGAs)獲得中國葡萄屬野生種秋葡萄(V.romanetii Roman)平利－7抗黑痘病候選基因DNA片段2個，對這些片段克隆測序後，其大小為507bp和510bp。以這2個序列為依據，可以進行抗黑痘病標記輔助育種，用作葡萄育種中檢測葡萄抗黑痘病基因的探針；可以根據這些片段在中國野生葡萄與歐洲葡萄雜種後代中的分離情況，進行抗黑痘病基因定位與作圖。
文檔編號C12N15/82GK1683534SQ20051004175
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月7日 優先權日2005年3月7日
發明者王躍進, 王西平 申請人:西北農林科技大學