一種從法夫酵母中分離純化蝦青素的方法
2023-06-02 15:43:01
一種從法夫酵母中分離純化蝦青素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從法夫酵母中分離純化蝦青素的方法，包括法夫酵母菌體破壁、丙酮粗提蝦青素、脫脂去除低極性類胡蘿蔔素、去除二甲基亞碸及結晶等步驟，通過有機試劑的高效提取及簡單分離純化步驟相結合，實現了快速分離蝦青素的目的，所製得的蝦青素純度高，雜質少，避免了使用常規的柱層析步驟，可以有效保持蝦青素的活性官能團，以在分離純化步驟中，維持蝦青素產品質量的穩定。
【專利說明】一種從法夫酵母中分離純化蝦青素的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及蝦青素的【技術領域】，尤其涉及一種從法夫酵母中分離純化蝦青素的方法。
【背景技術】[0002]蝦青素(astaxanthin)的化學名為:3，3』 - 二羥基-β，β 』 -胡蘿蔔素_4，4』 二酮，是一種極具開發潛力的營養色素和抗氧化劑，具有強抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗機體著色、抗癌等許多重要的生物學功能，在食品、醫藥、化妝品、水產養殖、畜禽養殖、化工等行業具有廣闊的應用前景。
[0003]蝦青素的生產方法可分成化學合成和生物合成。目前，化學法合成蝦青素工藝成熟，生產成本低，但與天然蝦青素相比，化學合成的蝦青素生物活性顯著較低。法夫酵母因顯著的蝦青素合成能力而備受關注，是天然蝦青素的重要來源。自法夫酵母被發現至今，有關法夫酵母的研究主要集中在高產菌株的選育、蝦青素髮酵條件的優化、蝦青素提取工藝的優化。有關蝦青素提取工藝的優化都是以蝦青素提取率作為指標，往往雜質含量高，不利於蝦青素的後續分離純化。現今報導的從法夫酵母中分離純化高純度蝦青素的方法都是採用柱層析法。柱層析不但操作繁瑣費時，且層析過程不利於蝦青素的穩定。
[0004]專利號為200410013634.7的發明專利「一種從法夫酵母中高效提取純化蝦青素的新工藝」公開了其純化蝦青素的方法，它是將物料與提取溶媒按比例混合後進行負壓空化混旋固液萃取，經離心得提取液，提取液減壓濃縮至小體積與萃取溶劑進行負壓空化混旋液萃取，萃取液水洗、脫水後減壓濃縮至油狀物，再經負壓柱層析和正壓柱層析純化得98%成品。該方法雖然蝦青素得率高，但純化工藝複雜，生產成本高，採用了負壓柱層析和正壓柱層析法，會造成蝦青素有效活性的丟失，因此不利於蝦青素的穩定。
[0005]郭建瑞等人在期刊《天然產物研究與開發》2007年第19期發表了一篇「紅酵母RY-4中蝦青素的分離純化研究」的文章，該研究以紅酵母為原料，通過破壁提取得粗色素油，再經層析法進一步分離純化得蝦青素，所得蝦青素產品純度達97%。在文章中，該方法也是採用了柱層析法進行蝦青素的純化，同樣對於蝦青素來說，也會造成其有效活性的丟失。
[0006]有關法夫酵母中蝦青素高效提取和簡單分離純化相結合的發明尚未見報導，因此，如何對蝦青素進行高效提取，採用簡單的分離純化步驟，避免採用柱層析法是本領域技術人員研究的重點。
[0007]有鑑於此，本發明人研究和設計了一種從法夫酵母中分離純化蝦青素的方法，本
案由此產生。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在於提供一種從法夫酵母中分離純化蝦青素的方法，通過有機試劑的高效提取及簡單分離純化步驟相結合，實現快速分離蝦青素的目的，並避免使用常規的柱層析步驟，以在分離純化步驟中，保護蝦青素的活性官能團。[0009]本發明解決其技術問題的所採用的技術方案是:
一種從法夫酵母中分離純化蝦青素的方法，包括以下步驟:
步驟一、法夫酵母菌體破壁:採用二甲基亞碸對法夫酵母菌體破壁，破壁條件為:菌體與二甲基亞碸按質量體積比，即g/ml，比例為1/2，在55°C溫度下，破壁5min ；
步驟二、丙酮粗提蝦青素:破壁後用丙酮按料液比1:15提取，所述料液比為法夫酵母菌體與丙酮的質量體積比，即g/ml，提取2次，合併提取液，低溫旋轉蒸發去除丙酮，殘留的組分為二甲基亞碸溶解的蝦青素粗提物，殘留組分即為蝦青素一次粗提液；
步驟三、脫脂及去除低極性類胡蘿蔔素:用石油醚萃取蝦青素一次粗提液，萃取比例為蝦青素一次粗提液:石油醚體積比1:2，萃取次數為2次，棄去上層石油醚，收集下層溶液，下層溶液即為蝦青素二次粗提液；
步驟四、去除二甲基亞碸:蝦青素二次粗提液與預冷到4°C的飽和氯化鈉水溶液按體積比1:3.5混合，混合液用乙酸乙酯進行萃取，乙酸乙酯的用量為蝦青素二次粗提液的3倍體積；收集乙酸乙酯相，低溫旋轉蒸發至幹，製得純度較高的蝦青素粉末；
步驟五、結晶:將步驟四製得的蝦青素粉末，加入二氯甲烷溶解，以溶解完蝦青素粉末為止，再往溶液中加入甲醇至有結晶析出為止，靜置，二氯甲烷自然揮發，使得蝦青素晶體析出^4°C、9961Xg離心條件下，離心10min，收集底部結晶即為蝦青素。
[0010]作為實施例的優選方式，在步驟一之前，還包括法夫酵母菌體收集的步驟，即法夫酵母發酵液 5534Xg，離心8min，棄上清，用蒸餾水洗後再次離心，重複操作2次，製得法夫酵母菌體。
[0011]作為實施例的優選方式，在步驟五之後，還包括高效液相色譜分析的步驟，所述高效液相色譜分析條件為:色譜條件為:35°c柱溫；474 nm檢測波長；洗脫劑為甲醇/水體系:0-40min 甲醇 85%_100% ;41_58min 甲醇 100% ;59_66min 甲醇 100%_85%;流速0.2ml/min ;色譜柱為:Angilent 2.1X1 OOmm C18 柱，3 μ m 粒徑。
[0012]由於本發明採用了上述技術方案，即本方案包括法夫酵母菌體破壁、丙酮粗提蝦青素、脫脂去除低極性類胡蘿蔔素、去除二甲基亞碸及結晶等步驟，通過有機試劑的高效提取及簡單分離純化步驟相結合，實現了快速分離蝦青素的目的，所製得的蝦青素純度高，雜質少，避免了使用常規的柱層析步驟，可以有效保持蝦青素的活性官能團，以在分離純化步驟中，維持蝦青素產品質量的穩定。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為石油醚萃取後薄層色譜分析圖譜；其中，標號1、2、3、4分別為提取液、石油醚萃取體系的下相二甲基亞碸、石油醚萃取體系的上相石油醚、蝦青素標準品；
圖2為加碘處理圖1後的圖譜，即石油醚萃取後薄層色譜分析後，再加碘處理；其中，標號1、2、3、4分別為提取液、石油醚萃取體系的下相二甲基亞碸、石油醚萃取體系的上相石油醚、蝦青素標準品；
圖3為乙酸乙酯萃取後薄層色譜分析圖譜；其中，標號1、2、3分別為乙酸乙酯萃取液、重結晶產物、蝦青素標準品；
圖4為加碘處理圖3後的圖譜，即乙酸乙酯萃取後薄層色譜分析後，再加碘處理；其中，標號1、2、3分別為乙酸乙酯萃取液、重結晶產物、蝦青素標準品；圖5為結晶奸青素後的奸青素HPLC圖。
【具體實施方式】
[0014]以下結合附圖和【具體實施方式】對本發明做進一步說明。
[0015]本發明揭示了一種從法夫酵母中分離純化蝦青素的方法，包括以下步驟:
步驟一、法夫酵母菌體破壁:採用二甲基亞碸對法夫酵母菌體破壁，破壁條件為:菌體
與二甲基亞碸按質量體積比，即g/ml，比例為1/2，在55°C溫度下，破壁5min ;採用二甲基亞碸破壁率高，提取效果好；處理短時間短(5min)，處理溫度低(55°C )有利於蝦青素結構的穩定;
步驟二、丙酮粗提蝦青素:破壁後用丙酮按料液比1:15提取，所述料液比為法夫酵母菌體與丙酮的質量體積比，即g/ml，提取2次，合併提取液，低溫旋轉蒸發去除丙酮，殘留的組分為二甲基亞碸溶解的蝦青素粗提物，殘留組分即為蝦青素一次粗提液；
步驟三、脫脂及去除低極性類胡蘿蔔素:用石油醚萃取蝦青素一次粗提液，萃取比例為蝦青素一次粗提液:石油醚體積比1:2，萃取次數為2次，棄去上層石油醚，收集下層溶液，下層溶液即為蝦青素二次粗提液；
石油醚萃取後，對提取液(蝦青素一次粗提液)、石油醚萃取體系的下相二甲基亞碸、石油醚萃取體系的上相石油醚及蝦青素標準品進行薄層色譜分析，本發明中薄層色譜的展開劑為丙酮/石油醚體積比=1/5，分析圖譜如圖1所示，從圖1可以看出，低極性的類胡蘿蔔素被萃取到石油醚相，二甲基亞碸相主要為蝦青素，其原因是蝦青素分子中有兩個羥基，極性比其他類胡蘿蔔素大。
[0016]後續再對圖1所示的圖譜`加碘處理，如圖2所示，從圖2結果可知，經石油醚萃取後，脂質等低極性的雜質基本上都萃取到石油醚相中，二甲基亞碸相基本不含脂質等低極性的雜質。
[0017]步驟四、去除二甲基亞碸:蝦青素二次粗提液與預冷到4°C的飽和氯化鈉水溶液按體積比1:3.5混合，混合液用乙酸乙酯進行萃取，乙酸乙酯的用量為蝦青素二次粗提液的3倍體積；收集乙酸乙酯相，低溫旋轉蒸發至幹，製得純度較高的重結晶產物蝦青素粉末；
此步的目的是從二甲基亞碸中回收蝦青素，因為二甲基亞碸的沸點很高(189°C)，不能通過旋轉蒸發的方法除去，此外，二甲基亞碸與水混合放熱，飽和氯化鈉水溶液在與二甲基亞碸混合前事先冷卻；氯化鈉可以幫助體系分層，避免乳化液的產生，形成清晰的兩相；不加氯化鈉體系不分層，因此氯化鈉在此操作過程中是不可或缺的；
步驟五、結晶:將步驟四製得的蝦青素粉末，加入二氯甲烷溶解，蝦青素在二氯甲烷中的溶解度是30mg/ml，以溶解完蝦青素粉末為止，再往溶液中加入甲醇至有結晶析出為止，靜置，二氯甲烷自然揮發，使得蝦青素晶體析出；在4°C、9961 X g離心條件下，離心10min，收集底部結晶即為蝦青素。
[0018]結晶後，對乙酸乙酯萃取液、結晶產物及蝦青素標準品進行薄層色譜分析，分析圖譜如圖3所示，後續再對圖3所示的圖譜加碘處理，如圖4所示。從圖3和圖4可知，結晶將與蝦青素極性相近的其他類胡蘿蔔素從蝦青素中去除掉，進一步提高了蝦青素的純度。
[0019]對結晶產物蝦青素進行高效液相色譜HPLC分析，所述高效液相色譜分析條件為:色譜條件為:35°C柱溫；474 nm檢測波長；洗脫劑為甲醇/水體系:0-40min甲醇85%-100% ；41-58min 甲醇 100% ;59_66min 甲醇 100%_85% ;流速 0.2ml/min ;色譜柱為:Angilent 2.1 X 100mm C18柱,3 μ m粒徑；HPLC分析圖譜如圖5所示,該圖譜只顯示一個主峰，其中17.7 min為蝦青素峰；1.5 min為溶劑峰，用溶解樣品的溶劑(甲醇)替代樣品進樣，此峰依然存在。
[0020]作為實施例的優選方式，在步驟一之前，還包括法夫酵母菌體收集的步驟，即法夫酵母發酵液5534Xg，離心8min，棄上清，用蒸餾水洗後再次離心，重複操作2次，製得法夫酵母菌體。
[0021]本發明包括法夫酵母菌體破壁、丙酮粗提蝦青素、脫脂去除低極性類胡蘿蔔素、去除二甲基亞碸及結晶等步驟，通過有機試劑的高效提取及簡單分離純化步驟相結合，實現了快速分離蝦青素的目的，所製得的蝦青素純度高，雜質少，避免使用常規的柱層析步驟，可以有效保持蝦青素的活性官能團，以在分離純化步驟中，維持蝦青素產品質量的穩定。
[0022]以上所述，僅為本發明較佳實施例而已，故不能依次限定本發明實施的範圍，即依本發明專利範圍及說明書內容所作`的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的範圍內。
【權利要求】
1.一種從法夫酵母中分離純化蝦青素的方法，其特徵在於:包括以下步驟: 步驟一、法夫酵母菌體破壁:採用二甲基亞碸對法夫酵母菌體破壁，破壁條件為:菌體與二甲基亞碸按質量體積比，即g/ml，比例為1/2，在55°C溫度下，破壁5min ； 步驟二、丙酮粗提蝦青素:破壁後用丙酮按料液比1:15提取，所述料液比為法夫酵母菌體與丙酮的質量體積比，即g/ml，提取2次，合併提取液，低溫旋轉蒸發去除丙酮，殘留的組分為二甲基亞碸溶解的蝦青素粗提物，殘留組分即為蝦青素一次粗提液； 步驟三、脫脂及去除低極性類胡蘿蔔素:用石油醚萃取蝦青素一次粗提液，萃取比例為蝦青素一次粗提液:石油醚體積比1:2，萃取次數為2次，棄去上層石油醚，收集下層溶液，下層溶液即為蝦青素二次粗提液； 步驟四、去除二甲基亞碸:蝦青素二次粗提液與預冷到4°C的飽和氯化鈉水溶液按體積比1:3.5混合，混合液用乙酸乙酯進行萃取，乙酸乙酯的用量為蝦青素二次粗提液的3倍體積；收集乙酸乙酯相，低溫旋轉蒸發至幹，製得純度較高的蝦青素粉末； 步驟五、結晶:將步驟四製得的蝦青素粉末，加入二氯甲烷溶解，以溶解完蝦青素粉末為止，再往溶液中加入甲醇至有結晶析出為止，靜置，二氯甲烷自然揮發，使得蝦青素晶體析出^4°C、9961Xg離心條件下，離心10min，收集底部結晶即為蝦青素。
2.如權利要求1所述的一種從法夫酵母中分離純化蝦青素的方法，其特徵在於:在步驟一之前，還包括法夫酵母菌體收集的步驟，即法夫酵母發酵液5534X g，離心8min，棄上清，用蒸餾水洗後再次離心，重複操作2次，製得法夫酵母菌體。
3.如權利要求1所述的一種從法夫酵母中分離純化蝦青素的方法，其特徵在於:在步驟五之後，還包括高效液相色譜分析的步驟，所述高效液相色譜分析條件為:色譜條件為:35°C柱溫；474 nm檢測波長；洗脫劑為甲醇/水體系:0_40min甲醇85%_100% ;41_58min甲醇 100% ；59-66min 甲醇 100%-85% ;流速 0.2ml/min ;色譜柱為=Angilent 2.1XlOOmmC18柱，3 μ m粒徑。`
【文檔編號】C07C403/24GK103848769SQ201410058649
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年2月21日 優先權日:2014年2月21日
【發明者】杜希萍, 倪輝, 黃高凌, 楊遠帆, 李利君, 肖安風, 蔡慧農 申請人:集美大學