一種羊棲菜多糖sfp－i及其分離純化方法與應用的製作方法

2023-06-02 08:42:36 1

專利名稱：一種羊棲菜多糖sfp－i及其分離純化方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，具體地說涉及一種多糖。
背景技術：
羊棲菜(Sargassum Fusiforme，SF)屬褐藻門馬尾藻科植物，是我國豐富的經濟海藻資源，藻體呈黃褐色，幹時發黑，高30～200cm，肉質，主軸圓柱形，直立，基部具短分枝，又名玉茜、鬍鬚泡、海大麥等，系多年生的暖溫性海藻。在我國主要分布在廣東、山東、福建、浙江等沿海地區，並出口到日本等國，而我國的羊棲菜開發才剛剛起步，幾乎處於空白。
B型肝炎是一種由B型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起的、流行久遠、傳播廣泛、嚴重危害人類健康的傳染性疾病。據估計目前全球範圍內大約有3.5億的HBV慢性攜帶者。我國是B型肝炎主要的流行區域，有超過10％的感染過HBV，HBV慢性攜帶者的人數幾乎佔全球的一半，現患慢性B型肝炎的病人已達到1000萬。對HBV的防治已成為我國乃至世界傳染病控制的首要問題之一。
藻類多糖具有較好的抗病毒作用已被大量的科學家所認可。多糖作為羊棲菜的最主要成分，含量佔細胞乾重的40％左右，這就為利用羊棲菜開發新型抗病毒藥品或食品提供了必要條件。本發明從羊棲菜中分離純化獲得一種多糖，經化學方法分析確定出化學結構，並通過藥理實驗證明該化學結構的多糖具有明顯的抗B肝病毒作用，可應用於藥品或保健食品中。

發明內容
本發明目的是針對現有B型肝炎治療存在的問題，提供一種從羊棲菜中分離的羊棲菜多糖SFP-I。
本發明的另一個目的是提供該羊棲菜多糖SFP-I分離純化的方法。
本發明的另一個目的是提供該羊棲菜多糖SFP-I在製備抗B肝病毒藥物或保健食品中的應用。
一種羊棲菜多糖SFP-I，經SepharoseCL-6B凝膠色譜柱層析，譜圖出現單一對稱峰，如圖1所示，表明純度已達到對其進行結構、藥理研究的要求。SFP-I經HPLC體系測定其分子量為1.2×105，經氣相色譜圖分析，如圖2，SFP-I的單體組成含有巖藻糖、半乳糖、木糖，各單糖之間的摩爾比為1∶0.4∶0.39。經紫外掃描圖譜，如圖3所示，除蛋白後的SFP-I在260nm和280nm附近均無蛋白質和胺基酸的特徵吸收峰，表明其不含蛋白質。SFP-I的13C-NMR譜圖中，如圖4，端基碳的化學位移δ均在102ppm以下，其中δ97-102ppm信號峰為C1訊號，表明其構型為α，這與IR譜圖(如圖5)、GC-MS譜圖(如圖6)分析結果是一致的。根據13C-NMR譜峰的指派，結合二糖、寡糖的化學位移表及文獻，以及高碘酸氧化和Smith降解結果，證明SFP-I多糖的一級結構是以-3-α-L-Fuc-(1，4)-α-L-Fuc-(1-殘基形成糖鏈，平均每6個單糖殘基中含有2個α1→2分支，其重複單元可表示如下
上述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其步驟如下所示(1)取羊棲菜加水浸提，超濾水浸提液，收集被截留部分，減壓濃縮、用無水乙醇沉澱，冷凍乾燥得羊棲菜粗多糖；(2)將羊棲菜粗多糖加水復溶，然後加入CaCl2溶液，離心，收集上清液；(3)上清液經減壓濃縮，再加入乙醇，離心；(4)離心後取上清液，上清液中再加入乙醇，離心取沉澱物；(5)將沉澱物溶於水，按Sevag法脫游離蛋白，以DEAE-cellulose為載體柱層析，依次用0.3mol/L NaCl、0.6mol/LNaCl、0.9mol/LNaCl和1.2mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，收集各洗脫液，各洗脫液透析、減壓濃縮、冷凍乾燥得固體物；(6)將上述經0.9mol/LNaCl洗脫所得的固體物溶於水，再進一步用SepharoseCL-6B柱層析純化，流動相為0.05mol/LNaCl溶液，流出液經透析、減壓濃縮、冷凍乾燥後得白色粉末狀羊棲菜多糖SFP-I。
上述步驟(1)所述的超濾水浸提液是用分子量為100000的超濾膜超濾水浸提液。
上述步驟(1)所述無水乙醇的用量是減壓濃縮後物體體積的3～8倍。
上述步驟(2)所述CaCl2溶液的濃度為4mol/L。
上述步驟(3)中上清液經減壓濃縮，再加入乙醇，使溶液中乙醇濃度為30～40％。
上述步驟(4)中，離心後取上清液，上清液中再加入乙醇使溶液中乙醇濃度為85～90％。
上述步驟(5)所述的Sevag法中，氯仿和正丁醇的體積比為4∶1。
上述步驟(6)中所述的固體物用量為80～100mg。
本發明的有益效果本發明從羊棲菜中提取了一種羊棲菜多糖SFP-I，該多糖能夠有效抑制B肝病毒，在製備用於預防和治療B肝的藥物及保健食品中有著重要的應用，其市場前景廣闊，價值高。


圖1為羊棲菜多糖SFP-I在SepharoseCL-6B凝膠色譜柱上的層析圖；圖2為糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖；圖3為羊棲菜多糖SFP-I除蛋白後的紫外掃描圖譜；圖4為羊棲菜多糖SFP-I的13C-NMR譜圖；圖5為羊棲菜多糖SFP-I的IR譜圖；圖6為羊棲菜多糖SFP-I的GC-MS譜圖；其中，在圖2中，A為標準單糖；B為SFP-I水解物。
具體實施例方式
實施例1 羊棲菜多糖SFP-I的分離純化
(1)取1kg羊棲菜乾品加水浸提，經響應面分析法優化條件為提取溫度85℃、自然pH值、水料重量比為28∶1、浸提1次的條件下，外加40W超聲波，每次10min，間隔10min，浸提1h，羊棲菜粗多糖的得率可達21.09％(佔原羊棲菜乾品重量)。
(2)用100000分子量的超濾膜超濾水浸提液，選取2.0MPa為操作進口壓力，室溫25℃作為超濾溫度。收集被截留部分，減壓濃縮至最小體積、用3～8倍無水乙醇沉澱，冷凍乾燥得羊棲菜粗多糖，得率為15.01％。
(3)羊棲菜粗多糖用適量水復溶，然後加入4mol/L CaCl2溶液，離心，收集上清液。上清液經減壓濃縮至最小體積，加入乙醇至溶液中乙醇濃度為30～40％，靜置後離心。離心後去沉澱，上清液中再加入乙醇使溶液中乙醇濃度為85～90％，離心得到沉澱，得率為3.63％。
(4)取沉澱0.15g溶於水，按Sevag法(氯仿∶正丁醇＝4∶1)脫游離蛋白，重複5次後，以DEAE-cellulose為載體柱層析，依次用0.3mol/LNaCl、0.6mol/L NaCl、0.9mol/LNaCl和1.2mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，收集各洗脫液，各洗脫液透析、減壓濃縮、冷凍乾燥得固體物。
(5)將上述經0.9mol/LNaCl洗脫所得的固體物80-100mg溶於水，再進一步用SepharoseCL-6B柱層析純化，流動相為0.05mol/LNaCl溶液，流出液經透析、減壓濃縮、冷凍乾燥後得白色粉末狀羊棲菜多糖SFP-I，得率為0.22％。
實施例2 羊棲菜多糖SFP-I對2215細胞內HBV-DNA的抑制作用
2215細胞內HBV-DNA提取在25cm2培養瓶中培養2215細胞，接種後24h加入羊棲菜多糖，設5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml及細胞對照各1瓶。加藥後培養12d(每4d換藥液1次)，取細胞對照及羊棲菜多糖各濃度處理細胞各1瓶，每瓶加細胞裂解液600μL，經37℃、2d裂解，11000g離心10min，吸取上清，加蛋白酶K至終濃度100μg/ml，56℃保存2h，收取上清，加等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1(V/V)，抽提2次，每次10min，10000g離心2min後，取上清，加兩倍體積無水乙醇沉澱DNA，真空抽乾，重溶於TE緩衝液中作為樣品。將提取得到的DNA稀釋成6個稀釋度，即1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，用HBV-DNA探針作斑點雜交，用酶標儀測定各點OD(570nm)值，計算不同濃度羊棲菜多糖對2215細胞內HBV-DNA的抑制率。HBV-DNA全基因探針的製備及膜的雜交、顯色均使用地高辛試劑盒。HBV-DNA全基因由大腸桿菌Am12經EcoR酶切獲得。
用羊棲菜多糖SFP-I的3個稀釋濃度5.0mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml處理2215細胞，第12d分別提取DNA，稀釋成6個稀釋度，即1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，用HBV-DNA探針作斑點雜交，用酶標儀測定各點OD(570nm)值，分析比較每批實驗結果，結果如表1所示。
表1 斑點雜交結果HBV-DNA檢測多糖濃度(mg/ml)細胞對照稀釋倍數 項目 52.5 1.25OD 0.36 0.44 0.65 0.56 0.68 0.70 0.86 0.791/2抑制率 60.90 55.71 37.60 42.30 17.58 19.90 - -1/4 OD 0.25 0.33 0.40 0.40 0.45 0.56 0.61 0.73
抑制率59.7057.9843.00 49.08 31.80 29.70- -OD0.23 0.24 0.280.310.450.53 0.46 0.521/8抑制率61.3068.7038.80 47.50 21.60 16.53- -OD0.11 0.16 0.120.150.270.31 0.34 0.211/16抑制率65.1459.2247.15 50.19 12.14 -- -OD0.12 0.09 0.130.120.140.21 0.22 0.311/32抑制率48.9064.2022.20 61.30 27.80 32.30- -OD0.09 0.05 0.130.050.170.09 0.14 0.161/64抑制率62.7172.8047.62 64.30 - 22.90- -X 59.7863.1039.39 52.45 15.57 20.23- -由表1可知，羊棲菜多糖SFP-I5mg/ml組HBV-DNA與細胞對照組HBV-DNA比較，平均抑制率達61.44％；2.5mg/ml組抑制率達45.92％；1.25mg/ml組抑制率為17.9％。由此說明羊棲菜多糖在2215細胞中無毒濃度條件下可抑制HBV-DNA的複製，抑制作用呈明顯的劑量-效應關係。
權利要求
1.一種羊棲菜多糖SFP-I，其特徵在於含有巖藻糖、半乳糖、木糖，其摩爾比為1∶0.4∶0.39，不含蛋白質，分子量為1.2×105，糖鏈化學結構以-3-a-L-Fuc-(1，4)-a-L-Fuc-(1-殘基形成主鏈，其重複單元結構為
2.權利要求1所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其步驟如下所示(1)取羊棲菜加水浸提，超濾水浸提液，收集被截留部分，減壓濃縮、用無水乙醇沉澱，冷凍乾燥得羊棲菜粗多糖；(2)將羊棲菜粗多糖加水復溶，然後加入CaCl2溶液，離心，收集上清液；(3)上清液經減壓濃縮，再加入乙醇，離心；(4)離心後取上清液，上清液中再加入乙醇，離心取沉澱物；(5)將沉澱物溶於水，按Sevag法脫游離蛋白，以DEAE-cellulose為載體柱層析，依次用0.3mol/L NaCl、0.6mol/LNaCl、0.9mol/LNaCl和1.2mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，收集各洗脫液，各洗脫液透析、減壓濃縮、冷凍乾燥得固體物；(6)將上述經0.9mol/LNaCl洗脫所得的固體物溶於水，再進一步用SepharoseCL-6B柱層析純化，流動相為0.05mol/LNaCl溶液，流出液經透析、減壓濃縮、冷凍乾燥後得白色粉末狀羊棲菜多糖SFP-I。
3.根據權利要求2所述的羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特徵在於步驟(1)所述的超濾水浸提液是用分子量為100000的超濾膜超濾水浸提液。
4.根據權利要求2所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特徵在於步驟(1)所述無水乙醇的用量是減壓濃縮後物體體積的3～8倍。
5.根據權利要求2所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特徵在於步驟(2)所述CaCl2溶液的濃度為4mol/L。
6.根據權利要求2所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特徵在於步驟(3)中上清液經減壓濃縮，再加入乙醇，使溶液中乙醇濃度為30～40％。
7.根據權利要求2所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特徵在於步驟(4)中，離心後取上清液，上清液中再加入乙醇使溶液中乙醇濃度為85～90％。
8.根據權利要求2所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特徵在於步驟(5)所述的Sevag法中，氯仿和正丁醇的體積比為4∶1。
9.根據權利要求2所述羊棲菜多糖SFP-I的分離純化方法，其特徵在於步驟(6)中所述的固體物用量為80～100mg。
10.權利要求1所述的羊棲菜多糖SFP-I在製備用於抗B肝病毒的藥物或保健食品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種羊棲菜多糖SFP－I。本發明的羊棲菜多糖SFP－I，是一種以巖藻糖為主的雜多糖，單體組成含有巖藻糖、半乳糖、木糖，這三種單糖的摩爾比為1∶0.4∶0.39，不含蛋白質，其分子量為1.2×10
文檔編號A61P1/16GK1651469SQ200410077730
公開日2005年8月10日 申請日期2004年12月29日 優先權日2004年12月29日
發明者李亞娜, 林永成, 佘志剛, 袁長青 申請人:中山大學