豬支原體肺炎疫苗株的製作方法

2023-06-02 08:52:26

豬支原體肺炎疫苗株的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株豬支原體肺炎疫苗株，其分類命名為豬肺炎支原體（Mycoplasma?hyopneumoniae），菌株號為NJ，已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO:M2012286，保藏日期：2012年7月16日。本發明的豬支原體肺炎疫苗株對豬有一定的致病性，具有良好的免疫原性。
【專利說明】豬支原體肺炎疫苗株
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種豬支原體肺炎疫苗株，屬於獸用生物製品領域。
技術背景
[0002]豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)是引起豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine, Mps又稱豬氣喘病)的主要病原，也是豬呼吸道疾病綜合症的一種重要的原發性病原。Mhp主要感染豬呼吸道，本身致病力不強，臨床症狀主要以咳嗽和氣喘為主，病變特徵主要是肺的尖葉、心葉、中間葉和隔葉前緣呈「肉樣」或「蝦肉樣」實變。Mhp感染機體後主要與呼吸道內壁的纖毛黏附，引起纖毛細胞病變和凋亡，導致纖毛斷裂和脫落，引 起機體發病，並且會嚴重影響豬的生長發育和飼料轉化率，或者破壞黏膜-纖毛屏障，容易繼發其他致病菌的感染(特別是對青年豬)，提高致死率，因而給養豬業造成巨大的經濟損失。目前豬支原體肺炎的主要防治措施是疫苗和藥物，但有效的藥物較缺乏，因此，進行該病的疫苗研製將為本病的預防和控制具有重要的意義。

【發明內容】

[0003]本發明所要解決的技術問題是提供一種豬支原體肺炎疫苗株，該疫苗株對豬有一定的致病性，培養滴度高且具有良好的免疫原性。
[0004]為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下:
[0005]—株豬支原體肺炎疫苗株，其分類命名為豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae),菌株號為NJ,已保藏於中國典型培養物保藏中心,地址:中國.武漢.武漢大學，郵編430072，保藏編號=CCTCC N0:M2012286，保藏日期:2012年7月16日。該菌株是發明人於2004年8月於南京某豬場自行採集篩選鑑定獲得一株豬支原體肺炎疫苗株。
[0006]有益效果:本發明具有下列突出的優點:
[0007]I)新菌株免疫原性好:本發明的豬支原體肺炎疫苗株為從國內分離培養選育的新菌株，具有良好的免疫原型，保證了疫苗的特異性和免疫效力。
[0008]2)新菌株生產疫苗簡便:本發明的豬支原體肺炎疫苗株為經過培育的地方分離菌株，具有高滴度的培養特性，保證了制苗用抗原的高滴度，減少了濃縮步驟；同時該菌株可用硫柳汞滅活，硫柳汞本身是一種防腐劑，用其來滅活兼顧了滅活和防腐，減少了用量，減少了對動物的不良反應；由於本發明的菌株具有良好的免疫原性，使的製備的滅活疫苗中免疫佐劑成分簡單，制苗方法簡便，簡化了生產工藝，降低了生產汙染的風險。
[0009]3)新菌株生產的疫苗安全高效:本發明的豬支原體肺炎疫苗株為經培育的地方分離株，具有培養滴度高、免疫原性好的特點，使用的佐劑為經過篩選獲得的油佐劑具有良好的免疫保護性，水性佐劑具有具有良好的安全性，保證了疫苗的安全和高效。
[0010]總之，本發明的滅活疫苗生產簡便、疫苗安全高效，能較好的滿足目前豬場的迫切需要，易於大範圍推廣應用，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)製備流程圖。
[0012]圖2豬肺炎支原體NJ株與其他菌株16s rRNA基因相似度比較。
[0013]圖3豬肺炎支原體NJ株與其他菌株16s rRNA基因進化樹。
[0014]圖4豬肺炎支原體NJ株與其他菌株P46基因相似度比較。
[0015]圖5豬肺炎支原體NJ株與其他菌株P46基因進化樹。
【具體實施方式】
[0016]下面的實施例將進一步說明本發明，而不限制本發明的範圍。
[0017]實施例1:豬肺炎支原體NJ株的選育
[0018]I菌株分離培養
[0019]將病肺組織進行研磨後，加入液體培養基(pH值7.4~7.6)中，置37°C培養3~10日後pH值降為6.6~7.0，輕度均一混濁。再接種固體培養基置37°C培養3~10日後，可見油煎蛋樣菌落，在固體培養基上傳代3次後，接種液體培養基，獲得豬肺炎支原體。
[0020]2 鑑定
[0021]將分離的豬肺炎支原體株置37°C培養3~10日後pH值降為6.6~7.0，輕度均一混濁，進行塗片，染色鏡檢見典型的豬肺炎支原體菌體。再接種固體培養基置37°C培養3~10日後，可見油煎蛋樣菌落。符合豬肺炎支原體的培養特性。
[0022]根據Genbank報導的豬肺炎支原體16s rRNA和P46基因序列分別設計引物，PCR擴增後，測序，測定的序列與已公布的全基因組序列進行ClustalW比對。
[0023]對於16s rRNA基因，NJ株與GenBank報導其他菌株的相似度為99.7%~100.0%,相似度比較見圖2，進化樹如圖3所示，NJ株16s rRNA序列見序列表SEQ ID No:1所示。對於P46基因，NJ株與GenBank報導其他菌株的相似度為98.7%~99.9%，相似度比較見圖4，進化樹如圖5所示，NJ株P46序列見序列表SEQ ID No:2所示。這說明豬肺炎支原體NJ株為豬肺炎支原體，且與其他菌株不同。
[0024]經培養特性、PCR和測序鑑定(序列見序列表SEQ ID No:1 )，分離獲得了豬肺炎支原體NJ株。
[0025]3菌株傳代
[0026]分離獲得的豬肺炎支原體NJ株，經液體傳代培養，每隔3代進行含量測定。結果含量從 105CCU/mL 上升到 101QCCU/mL。
[0027]4免疫原性測定
[0028]豬肺炎支原體NJ株的不同代次製備疫苗，然後各肌肉注射免疫7~15日齡健康易感豬，14日後再加強免疫；首免35日後，連同條件相同的對照豬，用豬肺炎支原體Js組織強毒氣管內注射攻毒，攻毒28日後剖檢，計算免疫組豬支原體肺炎肺病變指數減少率。結果各代次菌株製備的疫苗免疫組豬支原體肺炎肺病變指數減少率無差異。由此獲得的具有培養滴度高，免疫原性好的豬肺炎支原體NJ株。
[0029]實施例2:豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)的製備方法。
[0030]I菌株培養
[0031]菌株選用豬肺炎支原體NJ株，該菌株由我們分離鑑定，傳代培育後獲得，本菌株已於2012年7月16日送中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為:CCTCCM2012286。
[0032]2菌株特性
[0033]2.1形態和生化特性本菌為革蘭氏陰性多形態微生物，有環狀、球狀、點狀、杆狀和兩極狀，不易著色，無細胞壁。生化特性應符合細菌分類學中本菌的特性。
[0034]2.2培養特性在液體培養基(pH值7.4~7.6)中，置37°C培養3~7日後pH值降為6.6~7.0，輕度均一混濁，活菌滴度可達到IOkiCXUAiL以上。接種固體培養基，置37°C培養3~10日後,可見油煎蛋樣菌落。
[0035]液體培養基配方為=Eagles氏液1000mL,水解乳蛋白10.0g，豬血清200~400mL，鮮酵母浸出汁10~20mL，磷酸鹽緩衝液600mL，青黴素200~1000萬單位，0.4%酚紅
3.5mL，用 10g/L NaOH 調 pH 值為 7.4 ~7.6。
[0036]固體培養配方:在液體培養基中添加Noble Agar。
[0037]2.3血清學特性用代謝抑制試驗鑑定，接種到加有抗豬肺炎支原體血清的液體培養基中，在37°C下培養10日，與培養基對照相比不變色。
[0038]2.4毒力將菌株培養物經氣管內注射7~15日齡健康易感5mL，28日後剖檢，可見接種豬肺部出現典型的豬支原體肺炎病變。
[0039]2.5免疫原性按本發明製成疫苗，肌肉注射免疫7~15日齡健康易感豬，14日後再加強免疫；首免35日後，連同條件相同的對照豬，用豬肺炎支原體Js組織強毒氣管內注射攻毒，攻毒28日後剖檢，可`見免疫豬可顯著減少豬支原體肺炎肺病變。
[0040]3生產菌種的製備
[0041]取豬肺炎支原體NJ株凍幹菌種，用液體培養基稀釋後，接種固體培養基，在37°C下培養3~10日，選擇生長良好的菌落，純粹檢驗合格後，作為一級種子。再取一級種子接種液體培養基，在37°C下培養3~7日後pH值降為6.6~7.0收穫，經純粹檢驗合格後，作為二級種子。
[0042]4制苗用菌液的製備
[0043]取二級種子接種液體培養基，37°C培養3~7日，待培養物變色後進行擴大培養，繼代不超過6代，待pH值降為6.6~7.0時收穫，按照中國獸藥典的規定進行純粹檢驗和含量測定。
[0044]5抗原的滅活
[0045]將檢驗合格的制苗用菌液加入終濃度為0.005%的硫柳汞，37°C進行滅活。取滅活樣品ImL加入到50mL的液體培養基中，置37°C培養，觀察5日，再取0.5mL接種到4.5mL液體培養基中，置37°C培養，觀察10日，如兩次培養均不變色，判為滅活檢驗合格。
[0046]6配苗與混合
[0047]每頭份含滅活前豬肺炎支原體不少於2.86X IO8CXU,配苗比例由所用佐劑決定，抗原不足部分用PBS補足。
[0048]6.1注射用白油的配苗及混合取注射用白油94份(重量比)，司本-806份，加入油相罐中，攪拌均勻，經121°C滅菌30分鐘，冷卻至室溫備用。取滅活檢驗合格的菌液96份，吐溫-804份，加入水相罐中，攪拌混勻備用。將油相2~3份加入乳化罐中，先低速攪拌30分鐘，再緩慢加入1份水相，繼續攪拌均勻，用高速剪切機進行乳化，在乳化結束前加入終濃度為0.005% (g/mL)的硫柳汞溶液，製成油包水型乳液。[0049]6.2ISA206VG(SEPPIC)、ISA201VG(SEPPIC)、Gel01ST(SEPPIC)、ISAllRVG(SEPPIC)的配苗及混合按照說明書進行配苗和混合。如ISA201VG，按抗原和佐劑重量比50:50配苗，將佐劑預熱至31 °C，用低剪切力攪拌，維持在30°C，加抗原(水相)到佐劑中，攪拌均一即可。如ISAllR VG，按佐劑和抗原重量比15:85的比例配比，在室溫或更低溫度下將抗原水相加入佐劑中用低剪切力攪拌器攪拌均一即可。如GelOlST，佐劑按5%~20%配苗，在室溫或更低溫度下將抗原水相加入佐劑中用低剪切力攪拌器攪拌均一即可。
[0050]7成品檢驗
[0051]7.1性狀應符合所屬劑型。如用注射用白油應為油包水型，如用ISA201VG應為水包油再包水型，如用ISAllR VG應為水包油型，如用GelOlST應為水劑型。
[0052]7.2穩定性吸取疫苗IOmL加入離心管，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應不超過0.5mL。
[0053]7.3黏度按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，不超過200cP。
[0054]7.4無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，無菌生長。
[0055]7.5安全檢驗用7~15日齡健康易感豬5頭，各肌肉注射疫苗2mL，觀察14日後，除出現一過性體溫升高外，無由注射疫苗引起的其他局部和全身不良反應。
[0056]7.6效力檢驗用7~15日齡健康易感豬15頭，分為3組，分別為攻毒對照組、健康對照組和疫苗免疫組，每組5頭。疫苗免疫組各肌肉注射疫苗I頭份，14日後，再各肌肉注射疫苗I頭份。首免後35日，連同攻毒對照豬5頭，用生理鹽水稀釋的豬肺炎支原體Js株組織強毒，經氣管內注射攻 毒，每頭5mL。攻毒28日後，剖檢所有試驗豬，觀察記錄肺組織左尖葉、左心葉、左膈葉、右尖葉、右心葉、右膈葉、副葉病變百分比率，將O~25%記為I ;26~50%記為2 ；51~75%記為3 ；76~100%記為4，統計每個試驗豬病肺病變指數(最高為28)。肺病變指數減少率=(攻毒對照組肺病變指數平均值一免疫組肺病變指數平均值)/ (攻毒對照組肺病變指數平均值一健康對照組肺病變指數平均值)X100%，按上述公式計算豬支原體肺炎疫苗免疫組豬肺病變指數減少率。
[0057]7.7硫柳汞殘留量測定按現行《中國獸藥典》附錄進行測定，應符合獸用生物製品通則的規定。
[0058]8肌肉注射仔豬每頭肌肉注射I頭份。
[0059]實施例3:免疫效果觀察。
[0060]I 疫苗
[0061 ] 豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)油佐劑，豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)ISAl 1RVG,豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)GelOlST,國外某公司生產的豬支原體肺炎滅活疫苗。
[0062]2檢驗用強毒
[0063]豬肺炎支原體Js株組織強毒，由江蘇省農業科學院獸醫研究所製備。
[0064]3試驗豬
[0065]7~15日齡健康易感豬30頭，來源於江蘇省明天農牧科技有限公司。
[0066]4試驗設計
[0067]用豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)油佐劑，豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)ISAl 1RVG，豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)GelOlST，進口豬支原體肺炎滅活疫苗各I批，每批疫苗用7~15日齡仔豬5頭，每頭肌注ImL的疫苗，14日後以同等劑量加強免疫一次。同時設立條件相同的豬作攻毒對照組和健康對照組各5頭。疫苗免疫組首免後28日內觀察臨床反應。在首免後35日，疫苗免疫組和攻毒對照組試驗豬進行攻毒試驗，攻毒28日後剖檢，統計肺部病變記分，計算肺病變指數減少率。
[0068]5臨床反應觀察
[0069]試驗豬在注射疫苗後觀察28日，結果3個免疫組的試驗豬均在免疫後出現一過性發熱，但在免疫後三日內均恢復正常。未見其它異常臨床反應。
[0070]6效力比較試驗
[0071]試驗豬攻毒28日後內，觀察發現5頭攻毒對照組豬中有4頭出現不同程度的咳嗽，3個免疫組中各有I~2頭出現輕微咳嗽，健康對照未見咳嗽等豬支原體肺炎特徵性症狀。攻毒28日後剖檢，各組肺病變指數，計算肺病變指數減少率，效力比較試驗結果見表1。有結果可見，豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ)的3個不同佐劑的免疫組肺病變指數均顯著低於攻毒對照組和進口疫苗組。
[0072]表1同類疫苗效力比較試驗結果
[0073]
【權利要求】
1.一株豬支原體肺炎疫苗株，其分類命名為豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae),菌株號為NJ,已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號:CCTCCN0:M2012286，保藏日期:201`2年7月16日。
【文檔編號】C12R1/93GK103602637SQ201310608564
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月25日 優先權日:2013年11月25日
【發明者】劉茂軍, 邵國青 申請人:江蘇省農業科學院