一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管及其使用方法

2023-06-02 08:54:11 1

一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管及其使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種B型肝炎病毒(HBV)的全自動快速核酸檢測試劑管，操作簡單、反應快速、靈敏度高，還公開了該種B型肝炎病毒(HBV)的全自動快速核酸檢測試劑管的使用方法。本發明採用直通式定量PCR技術，將以納米磁珠為主的核酸自動化提取與螢光定量PCR反應有機結合，實現對B型肝炎病毒(HBV)核酸的全封閉全自動快速檢測，具有操作簡便易行，反應迅速，靈敏度高，操作環境相對寬鬆，無需建立專門的PCR實驗室，節省人力物力等優勢。
【專利說明】—種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種B型肝炎病毒(HBV)的全自動快速核酸檢測試劑管，還涉及該種B型肝炎病毒(HBV)的全自動快速核酸檢測試劑管的使用方法。
【背景技術】
[0002]B型肝炎病毒(hepatitisB virus, HBV)屬嗜肝 DNA 病毒科(hepadnaviridae)，主要侵犯肝細胞，在肝細胞內定居複製並損害肝細胞，引起肝細胞炎症、壞死、纖維化。我國目前B肝病毒攜帶率為7.18%，其中約三分之一有反覆肝損害，表現為活動性的B型肝炎或者肝硬化。B型肝炎病毒基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環狀DNA，共有四個開放讀框，分別編碼病毒的Core核衣殼蛋白和S包膜蛋白，病毒複製酶(聚合酶)及一種與病毒基因表達有關的蛋白質X。
[0003]B型肝炎病毒基因檢查的實驗室診斷主要依賴於血清特異性抗原抗體(ELISA)檢測和基因(DNA)檢測。ELISA方法是臨床診斷HBV感染的傳統手段，反映機體HBV感染的免疫狀態。而B型肝炎病毒基因(DNA)檢測則是採用聚合酶鏈反應(PCR)技術，特異性擴增B肝病毒基因組片段，以近於2n的指數(n為循環次數)，在數小時內可將極微量的B肝病毒基因(DNA)特定的分子 片斷擴增至IX IO7~IX IO8倍，大大提高了B型肝炎病毒的檢出率，PCR技術相對於ELISA方法，靈敏度高，特異性強，而且不受免疫學方法的「窗口期」限制影響，為臨床診斷HBV感染提供了一種強有力的手段。
[0004]然而，隨著PCR等分子診斷技術在臨床檢驗方面的推廣應用，其局限性也日益顯現。主要表現在兩個方面，一是由於常規PCR技術的高靈敏度，極易因微量樣品汙染產生假陽性結果，因此常規PCR檢測對操作人員的素質和操作環境都要求較高，按照衛生部的標準，國內醫院如在臨床檢驗項目上開展運用常規PCR技術，必須建立專用的PCR實驗室，並對操作人員進行專業培訓後才能進行，這必然提高了 PCR檢測的使用成本。二是目前在做PCR反應檢測之前，仍需依靠傳統的手工方式將臨床樣本中的核酸提取純化，然後再與PCR試劑混合進行檢測反應，程序繁瑣，耗時耗力，這在一定程度上限制了 PCR檢測在臨床診斷方面，特別是對大批量樣本檢測時的普及運用。
[0005]針對常規PCR技術的局限性，近年來出現了運用新興的納米核酸磁珠技術自動化提取生物樣本中的核酸，並聯機螢光定量PCR反應儀，實現從核酸提取到PCR反應的全自動核酸提取擴增系統。目前已有Roche、Cepheid、IQuum等公司出一管式全自動核酸提取擴增儀器，利用這些儀器平臺的全自動病原體核酸檢測技術能夠將核酸提取到PCR反應的過程在一根檢測管內的全自動完成，極大地提高工作效率，有效地消除了假陽性汙染風險，日益成為醫學分子診斷領域新的發展方向。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題就是提供一種操作簡單、反應快速、靈敏度高的B型肝炎病毒(HBV)的全自動快速核酸檢測試劑管。
[0007]本發明的另一目的是提供該種B型肝炎病毒(HBV)的全自動快速核酸檢測試劑管的使用方法。
[0008]為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案:一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管，包括用於裝入待測血清標本的待測血清標本腔及檢測試劑腔，所述檢測試劑腔包括:
[0009]用於裝入裂解緩衝液的裂解緩衝液腔，
[0010]用於裝入核酸提取磁珠的核酸提取磁珠腔，
[0011]用於裝入核酸提取洗滌液的核酸提取洗滌液腔，
[0012]用於裝入核酸提取洗脫液的核酸提取洗脫液腔，
[0013]用於裝入螢光定量PCR反應液的螢光定量PCR反應液腔，
[0014]以及用於裝入PCR反應引物和探針的PCR反應引物和探針腔；
[0015]所述PCR反應引物的序列為:
[0016]HBVl:5』-CGCACCTCTCTTT ACG-3，；
[0017]HBV2:5，-GGTGAAGCGAAGTGC-3，；
[0018]所述探針的序列為:
[0019]HBV-P:5』-CCGTCTGTGCCTTCTCATCT-3，。
[0020]優選的，所述裂解緩衝液為含有異硫氰酸胍的緩衝液。
[0021]優選的，所述裂解緩衝液包括以下組分:濃度為2mol/L的異硫氰酸胍、濃度為20X 10^3mol/L的檸檬酸鈉、濃度為0.lmol/L的P -巰基乙醇、質量分數為0.5%的十二烷基肌酸鈉、PH值為5.5的Tris-HCl緩衝液和濃度為IOX 10_3mol/L的溶劑。其中，溶劑為生理鹽水或其他適於配製裂解緩衝液的溶劑。
[0022]優選的，所述核酸提取磁珠為含有磁性納米微球的溶液。
[0023]優選的，所述核酸提取洗滌液包括以下組分:濃度為0.lmol/L的甘氨酸、質量分數為0.01%的ProCl in300系列防腐劑、pH值為5.5的Tri s-HCl緩衝液和濃度為IOX 10_3mol/L的溶劑。ProClin系列防腐劑的活性成分主要是2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMCI)。這兩種成分抑制細胞的生長以及促使細胞凋亡的原理相同。活性成分在與細胞膜接觸幾分鐘後，立即可以滲透到膜內並抑制細胞內酶的活性。
[0024]優選的，所述核酸提取洗脫液包括以下組分:濃度為150X10_3mol/L的氯化鎂水溶液、濃度為50g/L的牛血清白蛋白(BSA)、pH值為8.5的Tris-HCl緩衝液和濃度為10Xl(T3mol/L 的溶劑。
[0025]優選的，所述螢光定量PCR反應液包括以下組分:含有2.5U的PCR反應Taq酶的4倍濃度PCR反應緩衝液。
[0026]優選的，所述裂解緩衝液腔內裝有100 U L的裂解緩衝液，
[0027]核酸提取磁珠腔內裝有10 y L的核酸提取磁珠，
[0028]核酸提取洗滌液腔內裝有300 U L的核酸提取洗滌液，
[0029]核酸提取洗脫液腔內裝有20 y L的核酸提取洗脫液，
[0030]螢光定量PCR反應液腔內裝有10 ii L的螢光定量PCR反應液，[0031]PCR反應引物和探針腔內裝有IOii L的PCR反應引物和探針，
[0032]其中，PCR反應引物和探針的濃度分別為0.8 ii mol/L和0.4 ii mol/L。
[0033]優選的，所述每個腔之間通過105°C熱封閉分離。
[0034]該種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管的使用方法，依次包括以下步驟:
[0035]步驟一、全自動快速B型肝炎病毒核酸提取純化程序:
[0036]將50~100 ii L的待測血清標本裝入待測血清標本腔，將全自動快速核酸檢測試劑管放入全自動核酸檢測儀；
[0037]所述待測血清標本與裂解緩衝液腔內的裂解緩衝液混合均勻，樣本血清釋放核酸，時間30秒，得到混合液A ;
[0038]然後混合液A與核酸提取磁珠腔內的核酸提取磁珠混合均勻，核酸與磁珠結合，時間30秒，得到混合液B ；
[0039]全自動核酸檢測儀步進電機擠壓混合液B移去裂解液雜質，結合核酸的磁珠與核酸提取洗滌液腔內的核酸提取洗滌液混合均勻，洗滌純化核酸，時間40秒，得到混合液C ；
[0040]全自動核酸檢測儀步進電機擠壓混合液C移去洗滌液，結合核酸的磁珠與核酸提取洗脫液腔內的核酸提取洗脫液混合均勻，核酸自磁珠上分離至核酸提取洗脫液中，時間20秒，得到混合液D ;
[0041]步驟二、B型肝炎 病毒快速螢光定量PCR反應程序:
[0042]通過全自動核酸檢測儀步進電機的擠壓，將含有混合液D與螢光定量PCR反應液腔內的螢光定量PCR反應液、PCR反應引物和探針腔內的PCR反應引物和探針混合均勻，實施快速螢光定量PCR反應，控制溫度在95°C下2分鐘，進行預變性，再進行40個循環變溫過程:先控制溫度在95°C下4秒，再控制溫度在60°C下8秒，此為一個循環變溫過程；其中單個循環升、降溫時間均為4秒。
[0043]本發明採用直通式定量PCR技術，將以納米磁珠為主的核酸自動化提取與螢光定量PCR反應有機結合，實現對B型肝炎病毒(HBV)核酸的全封閉全自動快速檢測，主要優點如下:
[0044](I).操作簡便易行，將用於檢測B型肝炎病毒(HBV)的核酸提取試劑與螢光定量PCR反應試劑預裝入檢測試劑管，操作時只需一次性加入待檢樣品即可一管式完成全部反應，自動化程度高，消除了潛在的假陽性汙染風險。
[0045](2).反應迅速，B型肝炎病毒(HBV)核酸樣本抽提和定量PCR反應全部過程控制在20分鐘內完成，比現行的2~3小時反應時間大大縮短。
[0046](3).靈敏度高，目前的常規檢測方式只能從待測樣本核酸中吸取1/20~1/10量進行PCR反應(如從100 u L樣本核酸中取5~10 ii L)，而本發明中通過全自動化提取的待測樣本核酸將全部用於螢光定量PCR反應，靈敏度比現行方式提高10~20倍。
[0047](4).由於檢測方式實現全自動化反應，操作環境相對寬鬆，無需建立專門的PCR實驗室，節省人力物力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步描述:[0049]圖1為本發明B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管的結構示意圖；
[0050]圖2為本發明B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管的使用方法流程示意圖。
【具體實施方式】
[0051]實施例1
[0052]如圖1、2所示，為本發明一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管，包括用於裝入待測血清標本的待測血清標本腔1及檢測試劑腔，所述檢測試劑腔包括:
[0053]用於裝入裂解緩衝液的裂解緩衝液腔2，
[0054]用於裝入核酸提取磁珠的核酸提取磁珠腔4，
[0055]用於裝入核酸提取洗滌液的核酸提取洗滌液腔3，
[0056]用於裝入核酸提取洗脫液的核酸提取洗脫液腔5，
[0057]用於裝入螢光定量PCR反應液的螢光定量PCR反應液腔6，
[0058]以及用於裝入PCR反應引物和探針的PCR反應引物和探針腔7 ；
[0059]所述PCR反應引物的序列為:
[0060]HBVl:5』-CGCACCTCTCTTTACG-3，；
[0061 ] HBV2:5，-GGTGAAGCGAAGTGC-3，；
[0062]所述探針的序列為:
[0063]HBV-P:5』-CCGTCTGTGCCTTCTCATCT-3，。
[0064]所述裂解緩衝液腔2內裝有100 u L的裂解緩衝液，裂解緩衝液為含有蛋白質變性劑異硫氰酸胍的用於裂解細胞的緩衝液，具體包括以下組分:濃度為2mol/L的異硫氰酸胍、濃度為20X 10_3mol/L的檸檬酸鈉、濃度為0.lmol/L的P -巰基乙醇、質量分數為0.5%的十二烷基肌酸鈉、pH值為5.5的Tris-HCl緩衝液和濃度為IOX 10_3mol/L的溶劑。
[0065]所述核酸提取磁珠腔4內裝有10 uL的核酸提取磁珠，核酸提取磁珠為含有磁性納米微球的用於提取吸附RNA和DNA的溶液。
[0066]所述核酸提取洗滌液腔3內裝有300uL的核酸提取洗滌液，核酸提取洗滌液為用於洗滌磁珠表面雜質的溶液，具體包括以下組分:濃度為0.lmol/L的甘氨酸、質量分數為0.01%的ProClin300系列防腐劑、pH值為5.5的Tris-HCl緩衝液和濃度為1OX l0-3mol/L的溶劑。其中，溶劑為生理鹽水或其他適於配製裂解緩衝液的溶劑。
[0067]所述核酸提取洗脫液腔5內裝有20 y L的核酸提取洗脫液，核酸提取洗脫液用於洗脫吸附於磁珠表面的核酸，具體包括以下組分:濃度為150X10_3mOl/L的氯化鎂水溶液、濃度為50g/L的牛血清白蛋白、pH值為8.5的Tris-HCl緩衝液和濃度為1OX 10_3mol/L的溶劑。
[0068]所述螢光定量PCR反應液腔6內裝有10 i L的螢光定量PCR反應液，螢光定量PCR反應液包括以下組分:含有2.5U的PCR反應Taq酶的4倍濃度PCR反應緩衝液。
[0069]所述PCR反應引物和探針腔7內裝有1OiL的PCR反應引物和探針，PCR反應引物和探針的濃度分別為0.8 umol/L和0.4 umol/L。
[0070]所述每個腔之間通過105°C熱封閉分離。並將本發明的全自動快速核酸檢測試劑管長期保存於4°C環境下。[0071]如圖2所示，為該種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管的使用方法，依次包括以下步驟:
[0072]步驟一、全自動快速B型肝炎病毒核酸提取純化程序:
[0073]將50~100 ii L的待測血清標本裝入待測血清標本腔，將全自動快速核酸檢測試劑管放入全自動核酸檢測儀；
[0074]所述待測血清標本與裂解緩衝液腔2內的裂解緩衝液混合均勻，樣本血清釋放核酸，時間30秒，得到混合液A ;
[0075]然後混合液A與核酸提取磁珠腔4內的核酸提取磁珠混合均勻，核酸與磁珠結合，時間30秒，得到混合液B ；
[0076]全自動核酸檢測儀步進電機擠壓混合液B移去裂解液雜質，結合核酸的磁珠與核酸提取洗滌液腔3內的核酸提取洗滌液混合均勻，洗滌純化核酸，時間40秒，得到混合液C ；
[0077]全自動核酸檢測儀步進電機擠壓混合液C移去洗滌液，結合核酸的磁珠與核酸提取洗脫液腔5內的核酸提取洗脫液混合均勻，核酸自磁珠上分離至核酸提取洗脫液中，時間20秒，得到混合液D ;
[0078]步驟二、B型肝炎病毒快速螢光定量PCR反應程序:
[0079]通過全自動核酸檢測儀步進電機的擠壓，將含有混合液D與螢光定量PCR反應液腔6內的螢光定量PCR反應液、PCR反應引物和探針腔7內的PCR反應引物和探針混合均勻，實施快速螢光定量PCR反應，控制溫度在95 °C下2分鐘，進行預變性，再進行40個循環變溫過程:先控制溫度在95°C下4秒，再控制溫度在60°C下8秒，此為一個循環變溫過程；其中單個循環升、降溫時間均為4秒。全部PCR反應時間13分鐘完成。
[0080]實施例2
[0081]將本發明實施例1中的B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管用於檢測含有B型肝炎病毒DNA的質粒標準品。
[0082]將50 ii L含有B型肝炎病毒DNA質粒標準品的大腸桿菌液，加入本發明實施例1中的B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管，然後將檢測試劑管放入一管式全自動核酸提取擴增儀，按照實施例1中的使用方法設定反應程序，裂解30秒；磁珠結合30秒；洗滌40秒；洗脫20秒；快速螢光定量PCR反應，95 0C 2分鐘預變性，進行40個變溫循環，單個變溫循環包括95°C 4秒和60°C 8秒，全部反應時間約20分鐘完成。
[0083]將實施例2的檢測數據與以下對比實驗一、二進行對比。每組實驗均進行三次重複實驗，B型肝炎病毒DNA質粒標準品檢測的突光定量PCR反應Ct值檢測數據如表1所示。
[0084]對比實驗一，使用標準質粒DNA抽提試劑盒從50 y L大腸桿菌液中提取B型肝炎病毒DNA質粒，終體積20 ii L，將20 ii L DNA質粒加入預裝有螢光定量PCR反應液PCR反應引物和探針的檢測試劑管，然後將檢測試劑管放入一管式全自動核酸提取擴增儀，設定快速螢光定量PCR反應程序，950C 2分鐘預變性，進行40個變溫循環，單個變溫循環包括95°C 4秒和60°C 8秒，全部反應時間約13分鐘完成。
[0085]對比實驗二，使用標準質粒DNA抽提試劑盒從50 y L大腸桿菌液中提取B型肝炎病毒DNA質粒，終體積20 ii L，取2 ii L DNA質粒與18 y L的螢光定量PCR反應液在0.2mL常規PCR反應管中混勻，該PC·R反應液成份比例與本發明檢測試劑管中的螢光定量PCR反應液PCR反應引物和探針相同，然後將PCR反應管放入常規螢光定量PCR反應儀中，設定螢光定量PCR反應程序，950C 2分鐘預變性，進行40個變溫循環，單個變溫循環包括95°C 10秒和60°C 40秒，全部反應時間約75分鐘完成。
[0086]表1
[0087]
【權利要求】
1.一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管，其特徵在於:包括用於裝入待測血清標本的待測血清標本腔(I)及檢測試劑腔，所述檢測試劑腔包括: 用於裝入裂解緩衝液的裂解緩衝液腔(2)， 用於裝入核酸提取磁珠的核酸提取磁珠腔(4 )， 用於裝入核酸提取洗滌液的核酸提取洗滌液腔(3 )， 用於裝入核酸提取洗脫液的核酸提取洗脫液腔(5 )， 用於裝入螢光定量PCR反應液的螢光定量PCR反應液腔(6)， 以及用於裝入PCR反應引物和探針的PCR反應引物和探針腔(7)； 所述PCR反應引物的序列為:
HBVl:5』-CGCACCTCTCTTTACG-3』 ；
HBV2:5，-GGTGAAGCGAAGTGC-3，； 所述探針的序列為:
HBV-P:5』-CCGTCTGTGCCTTCTCATCT-3』。
2.根據權利要求1所述一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管，其特徵在於:所述裂解緩衝液為含有異硫氰酸胍的緩衝液。`
3.根據權利要求2所述一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管，其特徵在於:所述裂解緩衝液包括以下組分:濃度為2mol/L的異硫氰酸胍、濃度為20X 10_3mol/L的檸檬酸鈉、濃度為0.lmol/L的P -巰基乙醇、質量分數為0.5%的十二烷基肌酸鈉、pH值為5.5的Tris-HCl緩衝液和濃度為IOX 10_3mOl/L的溶劑。
4.根據權利要求1所述一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管，其特徵在於:所述核酸提取磁珠為含有磁性納米微球的溶液。
5.根據權利要求1所述一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管，其特徵在於:所述核酸提取洗滌液包括以下組分:濃度為0.lmol/L的甘氨酸、質量分數為0.01%的ProClin300系列防腐劑、pH值為5.5的Tris-HCl緩衝液和濃度為IOX 10_3mol/L的溶劑。
6.根據權利要求1所述一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管，其特徵在於:所述核酸提取洗脫液包括以下組分:濃度為150X10_3mol/L的氯化鎂水溶液、濃度為50g/L的牛血清白蛋白、pH值為8.5的Tris-HCl緩衝液和濃度為10X10_3mol/L的溶劑。
7.根據權利要求1所述一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管，其特徵在於:所述螢光定量PCR反應液包括以下組分:含有2.5U的PCR反應Taq酶的4倍濃度PCR反應緩衝液。
8.根據權利要求1所述一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管，其特徵在於:所述裂解緩衝液腔(2)內裝有IOOy L的裂解緩衝液， 核酸提取磁珠腔(4)內裝有IOy L的核酸提取磁珠， 核酸提取洗滌液腔(3)內裝有300 y L的核酸提取洗滌液， 核酸提取洗脫液腔(5)內裝有20 y L的核酸提取洗脫液， 螢光定量PCR反應液腔(6)內裝有10 ii L的螢光定量PCR反應液， PCR反應引物和探針腔(7)內裝有IOiiL的PCR反應引物和探針， 其中，PCR反應引物和探針的濃度分別為0.8 ii mo I/L和0.4 y mol/L。
9.根據權利要求1至8任意一項所述一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管，其特徵在於:所述每個腔之間通過105°C熱封閉分離。
10.權利要求1所述一種B型肝炎病毒的全自動快速核酸檢測試劑管的使用方法，其特徵在於:依次包括以下步驟: 步驟一、全自動快速B型肝炎病毒核酸提取純化程序: 將50~100 ii L的待測血清標本裝入待測血清標本腔，將全自動快速核酸檢測試劑管放入全自動核酸檢測儀； 所述待測血清標本與裂解緩衝液腔(2)內的裂解緩衝液混合均勻，樣本血清釋放核酸，時間30秒，得到混合液A ； 然後混合液A與核酸提取磁珠腔(4)內的核酸提取磁珠混合均勻，核酸與磁珠結合，時間30秒，得到混合液B ;全自動核酸檢測儀步進電機擠壓混合液B移去裂解液雜質，結合核酸的磁珠與核酸提取洗滌液腔(3)內的核酸提取洗滌液混合均勻，洗滌純化核酸，時間40秒，得到混合液C ；全自動核酸檢測儀步進電機擠壓混合液C移去洗滌液，結合核酸的磁珠與核酸提取洗脫液腔(5)內的核酸提取洗脫液混合均勻，核酸自磁珠上分離至核酸提取洗脫液中，時間20秒，得到混合液D ; 步驟二、B型肝炎病毒快速螢光定量PCR反應程序: 通過全自動核 酸檢測儀步進電機的擠壓，將含有混合液D與螢光定量PCR反應液腔(6)內的螢光定量PCR反應液、PCR反應引物和探針腔(7)內的PCR反應引物和探針混合均勻，實施快速螢光定量PCR反應，控制溫度在95°C下2分鐘，進行預變性，再進行40個循環變溫過程:先控制溫度在95°C下4秒，再控制溫度在60°C下8秒，此為一個循環變溫過程；其中單個循環升、降溫時間均為4秒。
【文檔編號】C12Q1/70GK103627820SQ201310608556
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月26日 優先權日:2013年11月26日
【發明者】夏放 申請人:諸暨脈達生物科技有限公司