一種微囊藻毒素分離純化的方法

2023-06-02 15:28:11

專利名稱：一種微囊藻毒素分離純化的方法
技術領域：
本發明涉及一種微囊藻毒素分離純化的方法，適合於野外收穫藍藻水華中二種微囊藻毒素MC-RR、[Dha7]MC-RR的純化。
背景技術：
藍藻毒素對環境和人群健康的危害已成為全球關注的重大環境問題之一，世界衛生組織(WHO)、聯合國科教文衛組織(UNESCO)等均對此問題表現出極大關注。近十年來，針對有毒藍藻和藍藻毒素的國際會議不斷召開，論文數量逐年遞增，其中研究最為廣泛是微囊藻毒素microcystin。迄今為止，已經鑑定的microcystin達70餘種，但商品化標準品則僅限於MC-LR、MC-RR及MC-YR等幾種，也僅有美、德、日等少數幾家公司(如Sigma、CalBiochem和Kanto Reagents等)可提供少量的這類純品，其價格在每克40萬美元左右，可以說，藍藻毒素純品的稀缺已成為困擾研究人員進行深入研究的主要「瓶頸」。近年來，隨著國際間將microcystin列入生化武器(Bioweapon)一類的「禁藥」，我國從國外定購這類產品變得越來越困難。
我國是世界上藍藻水華最嚴重、種類和分布都最為廣泛的國家之一，更為嚴重的是，我國湖泊80％的藍藻水華均含有毒素。近年來我國對藍藻毒素的研究日益增多，但受制於毒素純品難於獲得，許多研究無法深入開展。因此，研製開發在產量和純度上均滿足國內需求的藍藻毒素純品已成為亟需解決的問題。
我國的水華藍藻的主要微囊藻毒素種類為MC-RR、[Dha7]MC-RR和MC-LR，其中前二種毒素結構差異很小(見分子結構圖)，僅第7位胺基酸Mdha少一個甲基，在普遍採用的HPLC色譜條件下為同一色譜峰，無法分離，成為色譜分離中很難解決的一個問題。在已有的分離方法中，分子排阻色譜(凝膠色譜)、離子色譜和快速色譜均不能解決這個問題，從現有的研究看，僅有日本科學家採用製備薄層層析法(HPTLC)能夠分離這二種毒素，但也存在薄層層析板僅能一次使用，成本較高且上樣量較低的缺點。除此之外，未見有其它報導。
發明內容本發明的目的在於提供一種微囊藻毒素分離純化的方法。方法採用等梯度洗脫方式，穩定性好，分離效果好，上樣量較大，得到的MC-RR和[Dha7]MC-RR純度用HPLC-UV檢測達95％以上。
為了達到上述目的，本發明在篩選多種色譜材料和優化色譜條件的基礎上，確定了製備色譜柱及色譜條件。
1、藻毒素提取稱取一定量的幹藻粉，按20～50ml/g的比例加入75％甲醇，室溫下置於搖床上振蕩40～120min或在攪拌器上連續攪拌40～120min，取出後以3000～4500r/min的轉速離心10～30min，取出上清液。按此步驟重複提取1～3次，將幾次提取的上清液合併。
2、藻毒素初步純化將上清液於30～40℃旋轉蒸發濃縮至油狀，按Edwards(1996)提出的快速色譜法進行微囊藻毒素的初步純化，收集含MC-RR和[Dha7]MC-RR的組分，於30～40℃旋轉蒸發濃縮至幹，用2～20ml 70％甲醇定容。Edwards C.，Lawton L.，et al..Laboratory-scale purification of microcystins using flashchromatography and reversed-phase high-performance liquid chromatography.J.Chromat.A.1996734163-1733、製備色譜柱Hypersil ODS-BP C18反相色譜柱，內徑10～30mm，長250～300mm。
4、製備色譜條件流動相為甲醇∶0.01％三氟乙酸＝68∶32等梯度洗脫；流速6～20ml/min；柱溫20～40℃；進樣量1～5ml；檢測波長238nm；檢測器為製備色譜檢測池，最高耐壓1000psi。
5、MC-RR和[Dha7]MC-RR混合物檢測採用以下色譜條件，HypersilODS-BP(5μm，4.6×250mm)；流動相甲醇∶0.05％三氟乙酸＝65∶35等度洗脫；流速1ml/min；檢測波長238nm；進樣量10μL。在此色譜條件下，MC-RR和[Dha7]MC-RR為同一色譜峰，色譜如圖1所示。
6、分離純化後的MC-RR和[Dha7]MC-RR的檢測採用以下色譜條件，HypersilODS-BP(5μm，4.6×250mm)；流動相甲醇∶0.01％三氟乙酸＝68∶32等梯度洗脫；流速1ml/min；檢測波長238nm；進樣量10μL。在此色譜條件下，MC-RR和[Dha7]MC-RR可以完全分離，分離效果見圖2a、圖2b。
本發明與現有的分離技術相比，有以下的優點和效果1、解決了MC-RR和[Dha7]MC-RR的分離難題，在製備色譜條件下，二種毒素可實現完全分離。
2、上樣量較大，在實現完全分離的條件下，一次上樣量可高達200μg。
3、製備的毒素純度高，獲得的MC-RR和[Dha7]MC-RR用HPLC-UV檢測純度達95％以上。


圖1為採用一般的色譜條件，MC-RR和[Dha7]MC-RR無法分離的示意圖。
色譜條件Hypersil ODS-BP(5μm，4.6×250mm)；流動相甲醇∶0.05％三氟乙酸＝65∶35等度洗脫；流速1ml/min；檢測波長238nm；進樣量10μL。可以看出，在該色譜條件下，MC-RR和[Dha7]MC-RR為同一色譜峰。
圖2a為採用本發明的色譜條件，MC-RR完全分離效果圖。
圖2b為採用本發明的色譜條件，[Dha7]MC-RR完全分離效果圖。
色譜條件Hypersil ODS-BP(5μm，4.6×250mm)；流動相甲醇∶0.01％三氟乙酸＝68∶32等梯度洗脫；流速1ml/min；檢測波長238nm；進樣量10μL。可以看出，在此色譜條件下，MC-RR和[Dha7]MC-RR可以完全分離。
具體實施例方式
1、藻毒素提取稱取10g從滇池收穫的藍藻乾粉，加入250ml 75％甲醇，室溫下置於搖床上振蕩60min或在攪拌器上連續攪拌60min，取出後以4000r/min的轉速離心25min，取出上清液。按此步驟重複提取一次、兩次或三次，將幾次提取的上清液合併。
2、藻毒素初步純化將上清液於34℃旋轉蒸發濃縮至油狀，按Edwards(1996)提出的快速色譜法進行微囊藻毒素的初步純化，收集含MC-RR和[Dha7]MC-RR的組分，於34℃旋轉蒸發濃縮至幹，用20ml 70％甲醇定容。Edwards C.，Lawton L.，et al..Laboratory-scale purification of microcystins using flashchromatography and reversed-phase high-performance liquid chromatography.J.Chromat.A.1996734163-1733、製備色譜柱Hypersil ODS-BP C18反相色譜柱，內徑20mm，長300mm。
4、製備色譜條件流動相為甲醇∶0.01％三氟乙酸＝68∶32等梯度洗脫；流速10ml/min；柱溫25℃；進樣量1ml；檢測波長238nm；檢測器為製備色譜檢測池，最高耐壓1000psi。
5、MC-RR和[Dha7]MC-RR混合物檢測採用如下色譜條件，MC-RR和[Dha7]MC-RR為同一色譜峰。Hypersil ODS-BP(5μm，4.6×250mm)；流動相甲醇∶0.05％三氟乙酸＝65∶35等度洗脫；流速1ml/min；檢測波長238nm；進樣量10μL。
6、分離純化後的MC-RR和[Dha7]MC-RR的檢測採用如下色譜條件，MC-RR和[Dha7]MC-RR可以完全分離。Hypersil ODS-BP(5μm，4.6×250mm)；流動相甲醇∶0.01％三氟乙酸＝68∶32等梯度洗脫；流速1ml/min。檢測波長238nm；進樣量10μL。
權利要求
1.一種微囊藻毒素分離純化的方法，它包括下列步驟A、藻毒素提取稱取幹藻粉，按20～50ml/g的比例加入75％甲醇，室溫下置於搖床上振蕩40～120min或在攪拌器上連續攪拌40～120min，取出後以3000～4500r/min的轉速離心10～30min，取出上清液；B、藻毒素初步純化將上清液於30～40℃旋轉蒸發濃縮至油狀，按Edwards提出的快速色譜法進行微囊藻毒素的初步純化，收集含MC-RR和[Dha7]MC-RR的組分，於30～40℃旋轉蒸發濃縮至幹，用2～20ml 70％甲醇定容；C、製備色譜柱Hypersil ODS-BP C18反相色譜柱，內徑10～30mm，長250～300mm；D、製備色譜條件流動相為甲醇∶0.01％三氟乙酸＝68∶32等梯度洗脫，流速6～20ml/min，柱溫20～40℃，進樣量1～5ml，檢測波長238nm，檢測器為製備色譜檢測池，最高耐壓1000psi；E、MC-RR和[Dha7]MC-RR混合物檢測採用如下色譜條件，MC-RR和[Dha7]MC-RR為同一色譜峰，Hypersil ODS-BP 5μm，4.6×250mm，流動相甲醇∶0.05％三氟乙酸＝65∶35等度洗脫，流速1ml/min，檢測波長238nm，進樣量10μL；F、分離純化後的MC-RR和[Dha7]MC-RR的檢測採用如下色譜條件，MC-RR和[Dha7]MC-RR可以完全分離，Hypersil ODS-BP 5μm，4.6×250mm，流動相甲醇∶0.01％三氟乙酸＝68∶32等梯度洗脫，流速1ml/min，檢測波長238nm，進樣量10μL。
全文摘要
本發明公布了一種微囊藻毒素分離純化的方法。本方法以富營養化湖泊滇池的水華藍藻作為主要原料，經有機溶劑提取、快速色譜初步分離，最後用C
文檔編號C07K1/14GK1563081SQ200410012920
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月27日 優先權日2004年3月27日
發明者蕭邦定, 陳曉國, 劉劍彤, 劉永定, 宋立榮, 方濤 申請人:中國科學院水生生物研究所