叢枝菌根真菌菌株及其在抗根結線蟲中的應用的製作方法
2023-06-02 12:30:16 1
專利名稱：叢枝菌根真菌菌株及其在抗根結線蟲中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株叢枝菌根真菌菌株及其在抗根結線蟲中的應用。
背景技術：
根結線蟲(Meloidogyne)是危害最嚴重的植物病原線蟲之一，其種類多、分布廣、 致病性強，與其他病原菌複合侵染更加重了對作物的危害。我國蔬菜生產上的最主要的病 原線蟲種類有南方根結線蟲Meloidogyne incognita、北方根結線蟲M. hapla、爪哇根結 線蟲M. Javanica和花生根結線蟲M. arenaria，其中，南方根結線蟲的發生面積較大，佔發 生總量的77%，危害蔬菜的種類最多，已成為危害蔬菜的優勢種群。特別是近幾年，由於我 國北方保護地蔬菜的大面積種植，為根結線蟲的越冬提供了更適宜的條件，使保護地蔬菜 的根結線蟲病呈明顯加重趨勢，已成為保護地蔬菜生產的嚴重障礙。而目前防治根結線蟲 病的主要方法是採取化學方法，但是多數化學殺線蟲劑具有較高的毒性，無公害蔬菜生產 中不允許使用。蔬菜根結線蟲病的發生嚴重製約了蔬菜生產，降低了農民收入。因此，探索 新的防治方法特別是生物防治方法是十分必要的。 叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi ， AMF)是土壤中普遍存在的，能與 植物的根系形成互惠共生體，植物為菌根真菌的生長提供了碳源和能量，真菌則通過其外 生菌絲擴大根系的吸收面積，改善植物的營養狀況，包括養分和水分的吸收，特別是能提高 植物吸磷能力。除了在改善植物營養方面的作用外，叢枝菌根真菌與植物病害的關係也是 研究的熱門領域，其中抗線蟲病害的研究也是一個重要的方向。 研究認為叢枝菌根真菌與宿主植物根系形成菌根後，其根外菌絲能夠在土壤中縱 橫方向上延伸生長，增加了根系與土壤接觸的範圍和表面積，從而擴大了根系的吸收範圍， 改善了植株對土壤養分及水分的吸收，尤其是促進磷的吸收，增補的磷元素可補償線蟲帶 來的損失；叢枝菌根真菌還可以減少巨大細胞的形成，抵禦線蟲的入侵和進一步生長發育； 接種AM真菌的番茄根中，絲氨酸(serine)和苯丙氨酸(phenylManine)的含量明顯增加， 從而對根結線蟲的活性有抑制性作用；另外，叢枝菌根真菌可能改變植物的皮層結構，使其 不再適宜線蟲的取食，同時它可與線蟲競爭皮層的入侵位點，減少線蟲的入侵(王豔玲，胡 正嘉叢枝菌根真菌和植物寄生線蟲病[J].生物學雜誌，1999，16(6)3 5)。正是因為AM 真菌的這些作用，接種AM真菌能在一定程度上減輕根結線蟲對作物的危害。
發明內容
本發明的目的是提供一株叢枝菌根真菌菌株及其應用。 本發明所提供的叢枝菌根真菌菌株摩西球囊黴(Glomus mosseae)96022，已於 2009年11月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC， 地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No.3451。 所述叢枝菌根真菌菌株摩西球囊黴96022 CGMCC No. 3451的基本培養形態特徵為孢子在盆栽培養物中單生，或1-2很少3個叢生在孢子果中。孢子果多為不規則球形，
直徑240-380 m，黃棕-淺褐色，內含1_3個孢子，由鬆散的網狀菌絲形成孢被，孢被厚大 約15-23iim。孢子淺黃-黃棕色，球形或近球形，有時不規則，大小為115-160 iim。孢壁3 層外壁LI無色透明，易脫落，厚約1. 7-2. 1 m，Melzer' s試劑中呈淺粉紅色至深粉紅色； L2無色透明，1. 0-1. 3 ii m ;內壁L3淺黃-黃褐色，層狀壁，厚2. 8_4. 5 y m。孢子內含物為大 小不等的油滴或顆粒。連孢菌絲漏鬥形，連點寬20-35 iim，連點處菌絲壁稍增厚；連孢菌絲 底部有一厚凹隔。 本發明所提供的叢枝菌根真菌菌株摩西球囊黴96022 CGMCC No. 3451的用途是其 在防治植物根結線蟲中的應用；優選為在防治蔬菜根結線蟲中的應用，最優選為在防治黃 瓜根結線蟲中的應用。 所述根結線蟲選自下述至少一種南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)、北方 根結線蟲(Meloidogyne h即la)、爪哇根結線蟲(Meloidogyne Javanica)和花生根結線蟲 (Meloidogyne arenaria)。 以本發明所提供的叢枝菌根真菌菌株摩西球囊黴96022 CGMCC No.3451為活性成
分的生物菌劑也屬於本發明的保護範圍。需要的時候，該菌劑還可包含菌劑製備的常用載 體和輔料。 本發明通過盆栽試驗的方法研究了摩西球囊黴96022對根結線蟲的抗性，試驗結 果表明叢枝菌根真菌菌株摩西球囊黴96022能夠顯著增強黃瓜根系對養分的吸收能力，減 輕根結線蟲對黃瓜植株造成的危害，對黃瓜南方根結線蟲病害的防治效應達到了 41 % 。
具體實施例方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。 實施例1、叢枝菌根真菌菌株摩西球囊黴96022的分離與鑑定 菌株的分離2006年9月從雲南採集辣椒根際土壤，並從採集的土壤上分離菌株。 分離方法如下稱取50克辣椒根際土壤，放入大燒杯中加1000ml水，攪拌，靜置
10秒後過雙層分樣篩(上篩20目，下篩300目)，用水收集300目篩子上的殘留物於培養
皿中，在體式顯微鏡下挑取該菌株的單個孢子，接種於粒徑均為l-2mm等體積混合的河沙
與沸石混合物中，並種植高梁，培養三個月後，收穫內含有該菌株孢子、被侵染根段及根外
菌絲的沸石沙混合物。(河沙與沸石均能從商業途經獲得。) 菌株鑑定稱取50克含有該菌株孢子的沸石沙混合物(即上述分離方法得到的培 養物)，放入大燒杯中加1000ml水，攪拌，靜置10秒後過雙層分樣篩(上篩20目，下篩300 目)，用水收集300目篩子上的殘留物於培養皿中，在體式顯微鏡下挑取該菌株的孢子，置 於載玻片上，在生物顯微鏡下，觀察孢子形態，鑑定為該種。 形態學鑑定孢子在盆栽培養物中單生，或l-2很少3個叢生在孢子果中。孢子 果多為不規則球形，直徑240-380 ym，黃棕-淺褐色，內含1_3個孢子，由鬆散的網狀菌 絲形成包被，孢被厚大約15-23 iim。孢子淺黃-黃棕色，球形或近球形，有時不規則，大小 為115-160 iim。孢壁3層外壁Ll無色透明，易脫落，厚約1. 7-2. 1 y m， Melzer' s試劑中呈淺粉紅色至深粉紅色；L2無色透明，1. 0-1. 3 ii m ;內壁L3淺黃-黃褐色，層狀壁，厚 2. 8-4. 5iim。孢子內含物為大小不等的油滴或顆粒。連孢菌絲漏鬥形，連點寬20-35 iim，連 點處菌絲壁稍增厚；連孢菌絲底部有一厚凹隔。 叢枝菌根真菌菌株摩西球囊黴96022已於2009年11月16日保藏於中國微生物
菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學
院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No. 3451。 實施例2、叢枝菌根真菌菌株摩西球囊黴96022對根結線蟲的抗性鑑定 1材料與方法 1. l試驗時間和地點 試驗於2008年3月-2008年8月在北京市農林科學院植物營養與資源研究所溫 室完成。 1. 2供試材料 供試作物黃瓜(Cucumis sativus L.)，品種為北京204。 供試叢枝菌根真菌菌種叢枝菌根真菌菌株摩西球囊酶96022 CGMCC No. 3451。
供試線蟲南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)，從房山官道鄉溫室大棚番茄 根系挑取線蟲卵，室溫下孵化得到二齡幼蟲。 供試基質高溫滅菌粒徑均為l-2mm的等體積沸石和河沙的混合物。
1. 3試驗設計本試驗設不接種G. mosseae也不接種M. incognita禾口僅接禾中M. incognita的2個 對照處理CK0和CK，接種G. mosseae的處理，同時又接種M. incognita的處理，共計3個處 理，每個處理4個重複。隨即排列，育苗時接種G. mosseae,移栽後接種根結線蟲。
1. 4試驗方法 試驗採用高溫滅菌等體積混合的沸石和河沙育苗基質，育苗盤為黑色的50穴，經 84消毒液消毒後備用。每穴接種G. mosseae菌劑(每克菌劑含孢子約40個)4克，不接種 AM真菌對照處理加入等量的滅菌菌劑和4ml菌種濾液，以保證其它微生物的種類相一致。 出苗後30天定植到裝有2500克上述滅菌基質的盆中，每盆定植一株，緩苗一周後每盆接 種M. incognita 二齡幼蟲5000條。每盆每十天一次澆Hoagland營養液lOOrnl，其他按常 規管理。Hoagland營養液組成如下磷酸二氫鉀(0. 136g/L)，硝酸鉀(0. 505g/L)，硝酸牽丐 (1. 18g/L)，七水合硫酸鎂(0. 493g/L)，硼酸(2. 86mg/L)四水合氯化錳(1. 81mg/L)，七水合 硫酸鋅(0. 22mg/L)，五水合硫酸銅(0. 08mg/L)，鉬酸(0. 02mg/L) ， FeEDTA (EDTA7. 45mg/L與 七水合硫酸鐵5. 57mg/L組成)。 在盆栽條件下，黃瓜在溫室生長至60天收穫。植株在60-7(TC下烘72小時，稱 乾重並測定植株中的氮(凱氏法)、磷(釩鉬黃比色)含量。菌根侵染率採用墨水醋染色 法(Horst V， Andrew PC， Urs W， et al. Ink and vinegar, a simple stainingtechnique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Applied and Environmental Microbiology,1998， 64(12) :5004 5007.)，按加權平均方法計算根系侵染率。根結指數採用翟衡的方法(翟 衡，管雪強，趙春芝等，中國葡萄抗南方根結線蟲野生資源的篩選[J].園藝學報，2000， 27(1)27 34)，病情指數採用劉維志的方法(劉維志主編.植物線蟲學研究技術[M].沈 陽遼寧科學技術出版社，1995.36 42.鄭長英，曹志平，陳國康，陳雲峰，楊杭.番茄嫁接國生態農業學報，2005，13(4) :164-156)進行根結線蟲危 害分級，O級為無根結；1級為根結小於5個；2級為根結小於25個；3級為根結26-100個；
4級為有大量根結但大多數不連結在一起；5級為有大量根結且許多連結在一起；6級為根 結非常多且大多連在一起，根生長受到輕微阻礙；7級為大量侵染，根生長微弱；8級為大量
侵染，根停滯生長。
病情指數計算公式為 病情指數(％ ) = I](各級植株數X級值)/ (調查總株數X 8) X 100 防治效果(孫建華，齊軍山，馮欣等，Sr18生物殺線蟲製劑防治黃瓜根結線蟲病研
究[J].華北農學報，2005，20(4) :74 78)的計算公式分別為:防治效果(％ )=對照區病情指數-處理區病情指數/對照區病情指數X 100
應用SAS軟體對試驗數據進行統計分析，5%水平下LSD多重比較檢驗各處理平均 值之間的差異顯著性。
2結果與分析 2. 1G.mosseae 96022 CGMCC No. 3451對黃瓜根系的侵染率 從表1可以看出，未接種G. mosseae真菌的兩個對照處理菌根侵染率在苗期和移 栽後60天均為0，說明盆栽試驗條件未出現不同AM真菌間的互相干擾侵染。苗期30天，接 種G. mosseae處理的菌根侵染率為22. 8%，基本建立了菌根共生體。在移栽後60天時，其 菌根侵染率達到了 80%以上，說明AM真菌G. mosseae與黃瓜根系建立了良好的共生關係。
表1 G. mosseae在苗期30天和移栽後60天對黃瓜根系的侵染率的影響
侵染率(％) ^ 接種處理 _^_
苗期30天 移栽後60天
CKO 0. 0 b 0. 0 b CK+線蟲 0.0 b 0.0 b
《卿^ea^"線蟲 22.8 a 82.9 a 注應用LSD法檢驗處理間差異程度，同一豎欄中的不同字母 表示差異達到5%顯著水平(下同)。 2. 2接種G. mosseae 96022 CGMCC No. 3451和根結線蟲對黃瓜植株生長的影響 表2接種G. mosseae和根結線蟲對黃瓜生物量和株高的影響
接種處理地上部乾重(g)地下部乾重(g)株高(m)
CKO9.87 a1. 15 b2.39 a
CK+線蟲5.00 b0.70 c1.61 b
61膨5S636 2+線蟲10.73 a2.07 a2. 40 a 從表2可以看出，只接種根結線蟲而未接種G. mosseae的CK處理，其株高、地上部、地下部乾重均低於對照CK0，且差異顯著，表明在本試驗條件下，接種根結線蟲對黃瓜植 株造成了危害。接種G. mosseae的處理，三個指標均顯著高於只接種根結線蟲的CK處理， 且達到了未接種根結線蟲CK0處理水平。表明接種G. mosseae能夠減輕根結線蟲對黃瓜植 株造成的危害。 2. 3接種G. mosseae 96022 CGMCC No. 3451和根結線蟲對黃瓜植株養分吸收量的 影響 表3接種G. mosseae和根結線蟲對黃瓜植株吸氮、吸磷、吸鉀量的影響
接種處理 吸氮量mg/pot 吸磷量mg/pot 吸鉀量mg/pot~
285.22 ab 22.93 ab 239.78 a CK+線蟲 184.49 c 10.63 c 97.02 c
6".歷ossea^線蟲 325.82 a 23.82 a 224.43 ab 只接種根結線蟲處理的植株吸收氮、磷、鉀的量顯著低於未接種G. mosseae同時 未接種根結線蟲的CK0對照處理，也顯著低於接種G. mosseae處理(表3)，說明本試驗條 件下，根結線蟲嚴重抑制了黃瓜根系對養分的吸收，從而影響了黃瓜植株的生長，同時接種 G. mosseae顯著增強了黃瓜根系對養分的吸收能力，從而抑制了黃瓜根結線蟲的危害。
2. 4接種G. mosseae 96022 CGMCC No. 3451對黃瓜根結線蟲根結指數的影響
從表4可見，接種G. mosseae處理的黃瓜根結指數顯著低於只接種根結線蟲處理， 病情指數下降。表明接種AM真菌能夠明顯抑制根結線蟲對黃瓜根系的危害，起到了一定的 防治效果，其防治效應達到了 41%。
表4接種G. mosseae對黃瓜根結指數的影響
接種處理 根結指數(個/克)~~病情指數(％) 防治效應(％)
0.0 c 11
91.0 a 0.0
53. lb 41. 0
CK0 0.0 c ,,丄
CK+線蟲 74. 0 a
(7.衡s週^"線蟲 27.0b 試驗結果表明，叢枝菌根真菌Glomus mosseae對黃瓜南方根結線蟲病害具有防治 效果。 在上述試驗中，接種AM真菌顯著減低了黃瓜根結指數，這可能是由於AM真菌在根 系上侵染擴展的部位與南方根結線蟲佔據的部位相同，存在空間競爭，此外二者也可能存 在著養分競爭；也有可能是因為形成菌根後，一些線蟲不喜歡取食這類根系，由於菌根的發 育常常改變植物分泌物的種類和數量，這些變化有可能改變線蟲對根系的趨化性，影響其 需要孵化剌激因子的線蟲的孵化作用或根組織內直接受到抑制；還有可能是因為叢枝菌根 真菌侵染寄主根系時激起了寄主的防禦反應，提高了與抗病性有關的酶活性，從而使寄主 植物對病原物的再次進攻產生快速反應，提高了抗病性。 在設施栽培中，叢枝菌根的作用不僅體現在促進植物根系的養分吸收，更主要的 是增強作物抗逆性、抗病性和改善土壤理化性狀方面。AM真菌可以通過改善宿主植物的營
7養狀況，激活寄主防禦機制；促進合成一些次生代謝物質或生防物質，如酚類物質、黃酮類 等；通過改變植物內源激素平衡狀況影響微生物區分；與病原微生物競爭寄主侵染位點和 光合產物等途徑來減輕植物病害，特別是土傳病害。
權利要求
叢枝菌根真菌菌株摩西球囊黴(Glomus mosseae)96022CGMCC No.3451。
2. 叢枝菌根真菌菌株摩西球囊黴(Glomus mosseae)96022CGMCC No. 3451在防治植物 根結線蟲中的應用。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述植物為蔬菜。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述蔬菜為黃瓜。
5. 根據權利要求2-4中任一所述的應用，其特徵在於所述根結線蟲選自下述至少一 種南方根結線蟲Meloidogyne incognita、北方根結線蟲Meloidogyne hapla、爪哇根結線 蟲Meloidogyne Javanica禾口花生根結線蟲Meloidogyne arenaria。
6. 根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述根結線蟲為南方根結線蟲 (Meloidogyne incognita)。
7. —種防治植物根結線蟲的菌劑，其活性成分為權利要求1所述的叢枝菌根真菌菌株 摩西球囊黴(Glomus mosseae)96022CGMCC No. 3451。
8. 根據權利要求7所述的菌劑，其特徵在於所述植物為蔬菜，所述蔬菜優選為黃瓜。
9. 根據權利要求7或8所述的菌劑，其特徵在於所述根結線蟲選自下述至少一種 南方根結線蟲Meloidogyne incognita、北方根結線蟲Meloidogyne hapla、爪哇根結線蟲 Meloidogyne Javanica禾口花生根結線蟲Meloidogyne arenaria。
10. 根據權利要求9所述的應用，其特徵在於所述根結線蟲為南方根結線蟲 (Meloidogyne incognita)。
全文摘要
本發明公開了一株叢枝菌根真菌菌株及其在抗根結線蟲中的應用。該菌株為叢枝菌根真菌菌株摩西球囊黴(Glomus mosseae)96022CGMCC No.3451。本發明所提供的叢枝菌根真菌菌株摩西球囊黴(Glomus mosseae)96022可以在防治植物根結線蟲引起的病害中得到應用。盆栽試驗的結果表明，接種叢枝菌根真菌Glomusmosseae能夠明顯抑制根結線蟲對黃瓜根系的危害，起到了一定的防治效果，其防治效應達到了41％。
文檔編號A01N63/04GK101705192SQ20091024239
公開日2010年5月12日 申請日期2009年12月10日 優先權日2009年12月10日
發明者張淑彬, 王幼珊, 王美菊, 鄒國元 申請人:北京市農林科學院