微生物發酵製備菜籽肽的方法
2023-05-29 17:27:41 1
專利名稱：微生物發酵製備菜籽肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物發酵製備菜籽肽的方法。
背景技術：
我國是世界上油菜籽產量最大的國家，年產量已近1200萬噸，菜籽粕是菜籽油加工的主 要副產物，佔菜籽總量的65%，其中含蛋白35% 42%。菜籽蛋白胺基酸組成合理，賴氨酸、 胱氨酸和蛋氨酸的含量較高，與WHO/FAO推薦的胺基酸組成模式相近，營養價值等於或優於 動物蛋白，是一種優良的植物蛋白。但由於菜籽粕存在一些抗營養因子，如硫代葡萄糖甙、 植酸、多酚類物質等，加工過程中難以脫除，使菜籽粕只能應用於飼料或肥料工業，利用效 能低，資源浪費嚴重。因此，開發利用菜籽蛋白質資源己成為大勢所趨，由於菜籽蛋白水解 成多肽後，具有更好的生物活性和加工特性，因此加強對菜籽肽的研究與開發，並使之工業 化，對有效利用我國的植物蛋白資源，提高我國人民的營養水平，具有重大的社會意義和良 好的經濟效益。
目前我國對菜籽肽的研究生產剛剛起步，其方法主要為酶法，即是以菜籽分離蛋白為原 料，利用商業蛋白酶製劑水解菜籽蛋白製備菜籽肽。該方法以菜籽分離蛋白為原料，生產所 用酶製劑用量大且價格昂貴，導致生產成本較高，並且由於菜籽粕或菜籽分離蛋白中抗營養 因子不能完全脫除，影響了蛋白酶的活性，水解程度不高，難以形成大規模工業化生產。
CN200810243461. 6、 CN200810106919. 3公開了生物發酵方法對菜籽粕改性的方法，雖然 脫除了大部分菜籽蛋白中的硫代葡萄糖甙(以下簡稱硫甙)等有害物質，得到菜籽肽或含有 菜籽肽的產品，但是產品的可溶性氮含量和生物活性仍有待進一步提高，且仍有一定量的硫 代葡萄糖甙殘留於產品內。
發明內容
本發明提供一種微生物發酵製備菜籽肽的方法，充分發揮微生物的水解蛋白質作用和降解硫甙作用，可以有效提高產品的可溶性氮含量和生物活性。 所述微生物發酵製備菜籽肽的方法，包括以下步驟
(1) 將菜籽粕粉與營養液混合製備液態發酵培養基；
(2) 將地衣芽孢桿菌接入液態發酵培養基，進行液態發酵；
(3) 發酵後的液態培養基經固液分離，得到菜籽肽的粗提液；
(4) 粗提液經提純得到菜籽肽。
步驟(1)中，菜籽粕粉與營養液按固液比1:5 1:40 g/mL配製液態發酵培養基，其中 營養液的pH為8. 0 10. 0，營養液中包括葡萄糖O. 1% 2%， MnS04 0. 1% 2. 0%，上述百分比 為質量體積百分比(質量體積百分比指100ml溶液中含某種物質多少克，即P/Flg/100ml)。 所述固液比優選為l: 15 1: 20 g/mL，營養液的pH為9.0 10。菜籽粕粉的粒徑不大於200 y m。
步驟(2)中，將地衣芽孢桿菌接入液態發酵培養基，使菌體濃度為l(^ l(/個/mL，發 酵溫度25 4(TC，發酵時間1 5天。優選的方案是，地衣芽孢桿菌分別經活化、擴大培養得 到菌體濃度為107 108個/1^的種子液，接入液態發酵培養基。種子液的接種量優選為2% 8%，更優選為3%-5%，以種子液相對於液態發酵培養基體積的百分比計。
所述地衣芽孢桿菌活化、擴大培養均採用常規方法， 一般得到種子液的方法如下將地 衣芽孢桿菌接種於斜面培養基上培養，然後挑取地衣芽孢桿菌接種於種子培養基中進行擴大 培養，其中斜面培養基配方為牛肉膏3 g，蛋白腖IO g， NaCl 5g，瓊脂20 g，水1000mL， pH 7.2-7.4，種子培養基配方為牛肉膏3 g，蛋白腖10g， NaCl 5 g，水1000mL， pH 7.0。
步驟(3)可以公知的方法進行固液分離，如可以採用真空過濾器或壓力過濾器去除殘 渣，也可以採用離心法，相對離心力為2500g 10000g。
作為本發明的優選方案，步驟(4)中，所述提純方法為脫色、脫鹽和乾燥。優選的 方案是，將粗提液採用活性炭脫色，離子交換樹脂或反滲透脫鹽，採用減壓濃縮、熱風乾燥 、冷凍乾燥或噴霧乾燥方式乾燥，得到菜籽肽粉。
作為本發明的另一種優選方案，步驟(4)中，所述提純方法包括離子交換、疏水層析
和凝膠過濾，收集具有抗氧化生物活性的組分，經冷凍乾燥得到抗氧化性專一的菜籽肽。當然也可以採用其餘的分離純化方法，如超濾膜進行超濾，收集不同截留分子量的濾液，經脫 鹽柱脫鹽，經過凝膠過濾，收集具有生物活性專一的組分，經冷凍乾燥後得到菜籽肽。當超 濾膜截留分子量較小時，則可直接經凝膠過濾，得到菜籽肽，如所述超濾膜為截留分子量為 3kDa的超濾膜，分子量《3kDa的組分經過凝膠過濾，色譜條件條件為填料為反相層析凝膠 ，流速lmL/min，溫度25'C，流動相為pH值7.0的磷酸鹽緩衝液。
本發明與現有的技術相比，直接以菜籽粕為原料微生物液態發酵生產生物活性專一的菜 籽肽，原料來源廣泛，價格低廉，不需要對其進行酸、鹼的處理，更不需要分離出菜籽蛋白 ，生產工藝簡單、成本低，而且變廢為寶，有利於環境保護，以微生物發酵取代純酶製劑水 解菜籽蛋白製備多肽，可以節省大量昂貴的生物酶製劑。選用地衣芽孢桿菌，進行液態發酵 ，產生多種代謝產物和酶類，充分發揮其水解蛋白質作用和降解硫甙作用，能有效降解菜籽 粕種的有毒物質，水解蛋白質，達到人和動物的食用標準，提高產品的可溶性氮含量、生物 活性和菜籽肽得率，還含有多種對人體有益的功能因子。總之，本發明對環境友好，反應條 件溫和，能充分發揮微生物的水解蛋白質作用和降解硫甙作用，是一種低成本、適合工業化 大批量製備菜籽肽的方法。
具體實施例方式
實施例l
(1) 製備液態發酵培養基
營養液成分葡萄糖2.0 g， MnS041.0 g，自來水IOOO mL， pH為9. 5。將雙低菜籽粕粉 碎至粒徑為100ym左右，用營養液按固液比1:15 g/mL的比例與菜籽粕混合均勻，在121。C下 滅菌30min後得到液態發酵培養基置於發酵罐內。
(2) 液態發酵 ①種子液的製備
斜面培養基配方牛肉膏3 g，蛋白腖IO g， NaCl 5，瓊脂20 g，自來水1000mL， pH 7. 2-7. 4。
種子培養基配方牛肉膏3 g，蛋白腖IO， NaCl 5 g，自來水1000mL， pH 7.0。 從活化後的菌種培養斜面中，挑取兩環地衣芽孢桿菌接種於種子培養基中，8層紗布封口， 35°C， 120r/min，搖床培養24h，得到菌體濃度達到l8個/mL的種子液。
②取種子液接入裝有發酵培養基的發酵罐中，使菌體濃度為106個/mL，調發酵溫度為31 °C，轉速180r/min震蕩培養，定時通風，發酵1 2天。
(3) 固液分離，得到菜籽肽的粗提液
取出發酵培養基，先用2500g相對離心力低速離心分離去除粕渣，再用10000g相對離心 力高速離心去雜，得菜籽肽粗提液，將該菜籽肽粗提液噴霧乾燥後測得菜籽肽得率為30 32%。
(4) 提純
上述粗提液分別通過截留分子量為1 OkDa的超濾膜進行超濾，將分子量小於1 OkDa的組分 經過離子交換柱(HiTrap 離子交換柱Q XL;流速lmL/min; Tris-HCL緩衝液pH8. 0，溫 度25°C)，疏水層析(HiTrapTM疏水層析柱PhenyL FF;流速lmL/min;溫度25°C)和 凝膠過濾(Superdex P印tide HR 10/30;流速0. 2mL/min;溫度25°C)，收集具有抗氧 化生物活性的組分，經冷凍乾燥後得到抗氧化性專一的菜籽肽。
所得菜籽肽的抗氧化生物活性指標如下 菜籽肽還原能力產品濃度lmg/mL時，A70(^為0.951;
自由基清除率產品濃度lmg/mL時，DPPH*自由基清除率為85%; 金屬螯合力產品濃度5mg/mL時，金屬螯合力為45%; 脂質氧化抑制率產品濃度lmg/mL時，脂質氧化抑制率為50%。 實施例2
與實施例l不同之處在於，按下述方法進行(4)提純
將上述粗提液分別通過截留分子量為3kDa的超濾膜進行超濾，分子量《3kDa的組分經過 凝膠過濾(柱SOURCE 5RPC，流速lmL/min，溫度25。C;磷酸鹽緩衝液pH7.0)，收集具 有降血壓生物活性的組分，經冷凍乾燥後得到生物活性專一的菜籽肽。該生物活性專一的菜 籽肽降血壓生物活性指標為抑制50。/。的ACE (血管收縮素轉移酶)活性所需抑制劑的濃度( IC50)為O. 15 mg/mL。實施例3
與實施例l不同之處在於，按下述方法進行(4)提純
調節菜籽肽粗提液pH至6. 5 7. 5，加入10g/L的活性炭，於5(TC脫色、脫苦lh，然後高 速離心(相對離心力為12000g)去雜，經脫鹽柱(HiPrep 26/10，流速30 mL/min)脫鹽 後，再經噴霧乾燥獲得菜籽肽，其蛋白質含量(幹基，NX6.25) 82.5%，可溶性氮含量90% ，分子量在500Da 5000 Da的肽含量60。/。，硫甙未檢出。本發明所得菜籽肽可溶性氮含量和 分子量在1000Da 5000Da的肽含量都很高，因此產品的溶解性較好，有利於腸道吸收和生物 活性功能的發揮，硫甙未檢出，產品安全性更好。
權利要求
1.一種微生物發酵製備菜籽肽的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將菜籽粕粉與營養液混合製備液態發酵培養基；(2)將地衣芽孢桿菌接入液態發酵培養基，進行液態發酵；(3)發酵後的液態培養基經固液分離，得到菜籽肽的粗提液；(4)粗提液經提純得到菜籽肽。
2 如權利要求l所述的微生物發酵製備菜籽肽的方法，其特徵在於步驟(1)中，菜籽粕粉與營養液按固液比1:5 1:40 g/mL配製液態發酵培養基，其中營養液 的pH為8. 0 10. 0，營養液中包括葡萄糖O. 1% 2%， MnS040. 1% 2. 0%，上述百分比為質量體 積百分比。
3 如權利要求2所述的微生物發酵製備菜籽肽的方法，其特徵在於步 驟(1)中，所述固液比為l: 15 1: 20 g/mL，營養液的pH為9. 0 10。
4 如權利要求l所述的微生物發酵製備菜籽肽的方法，其特徵在於步 驟(1)中，菜籽粕粉的粒徑不大於200ym。
5 105 107個/mL ，發酵溫度25 40。C，發酵時間1 5天。
6 如權利要求5所述的微生物發酵製備菜籽肽的方法，其特徵在於步 驟(2)中，地衣芽孢桿菌分別經活化、擴大培養得到菌體濃度為107 108個/mL的種子液， 接入液態發酵培養基。
7 如權利要求6所述的微生物發酵製備菜籽肽的方法，其特徵在於步 驟(2)中，種子液的接種量為2% 8%。
8 如權利要求l-4中任一項所述的微生物發酵製備菜籽肽的方法，其 特徵在於步驟(4)中，所述提純方法為脫色、脫鹽和乾燥。
9 如權利要求l-4中任一項所述的微生物發酵製備菜籽肽的方法，其特徵在於步驟(4)中，所述提純方法包括離子交換、疏水層析和凝膠過濾，收集具有抗氧 化生物活性的組分，經冷凍乾燥得到抗氧化性專一的菜籽肽。
10 如權利要求l-4中任一項所述的微生物發酵製備菜籽肽的方法， 其特徵在於步驟(4)中，所述提純方法包括通過超濾膜進行超濾，經過凝膠過濾，收集生 物活性專一的組分。
11 如權利要求10所述的微生物發酵製備菜籽肽的方法，其特徵在於 步驟(4)中，所述超濾膜為截留分子量為3kDa的超濾膜，分子量《3kDa的組分經過凝膠過 濾，色譜條件條件為填料為反相層析凝膠，流速lmL/min，溫度25'C，流動相為pH值7.0的磷酸鹽緩衝液。
全文摘要
本發明涉及一種微生物發酵製備菜籽肽的方法，充分發揮微生物的水解蛋白質作用和降解硫甙作用，可以有效提高產品的可溶性氮含量和生物活性。所述微生物發酵製備菜籽肽的方法，包括以下步驟(1)將菜籽粕粉與營養液混合製備液態發酵培養基；(2)將地衣芽孢桿菌接入液態發酵培養基，進行液態發酵；(3)發酵後的液態培養基經固液分離，得到菜籽肽的粗提液；(4)粗提液經提純得到菜籽肽。本發明生產工藝簡單、成本低，選用地衣芽孢桿菌，進行液態發酵，產生多種代謝產物和酶類，充分發揮其水解蛋白質作用和降解硫甙作用，能有效降解菜籽粕種的有毒物質，水解蛋白質，提高產品的可溶性氮含量、生物活性和菜籽肽得率。
文檔編號C12P21/06GK101654693SQ20091030594
公開日2010年2月24日 申請日期2009年8月21日 優先權日2009年8月21日
發明者榮 何, 朱均旺, 王立峰, 建 袁, 晶 金, 鞠興榮, 高瑀瓏 申請人:南京財經大學