人體蛋白cd2上糖鏈的甘露八糖的簡易合成的製作方法

2023-05-29 22:16:41 1

專利名稱：人體蛋白cd2上糖鏈的甘露八糖的簡易合成的製作方法
技術領域：
本發明屬於有生物活性的寡糖的製備領域，特別是涉及能用於藥物篩選的寡糖的合成方法。
人體重要的，有防衛作用的蛋白CD2含有與天冬醯胺連接的寡糖鏈，具有如下的結構 這個寡糖由八個甘露糖分子與兩個乙醯氨基葡萄糖分子組成，研究表明這個寡糖鏈對蛋白CD2的生物功能非常重要，去掉糖鏈的蛋白CD2不再具有黏附和抗體的功能(見M.A.Recny，等J.Biol.Chem.1992，267，22428-22434；A.R.N.Arulanandam，等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1993，90，11613-11620).因此糖鏈的結構對蛋白的功能影響很大。以上結構式的括弧中所示的即是這個甘露八糖，製備這個甘露八糖對研究整個糖鏈至關重要，且這個甘露八糖本身就可能具有重要的生物活性，本專利將首次報導它的簡明製備。其特點是用部分保護的糖為受體，通過高區選糖基化的方法來製備。
本發明的合成方法在於以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲醯基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(9)為起始物進行甘露八糖的簡易合成。
以甘露糖苷1為糖基受體，以α1→2連接的甘露雙糖三氯乙醯亞胺酯2為糖基供體，一步法縮合成3，6位連接的甘露五糖3，脫掉乙叉基再乙醯化，選擇性地脫掉1位乙醯基然後用三氯乙睛活化即得到五糖供體4。如下反應式所示 Bz＝苯甲醯基，Ac＝乙醯基α1→2連接的甘露雙糖三氯乙醯亞胺酯的糖基供體2由甘露糖原酸酯7縮合，得到α1→2連接的甘露雙糖8，脫掉烯丙基後再用三氯乙睛活化1位即得到2，而糖的原酸酯7由乙醯基溴代甘露糖5製備，如下反應式所示 Bz＝苯甲醯基，Ac＝乙醯基All＝烯丙基使4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷與雙糖供體2縮合，選擇性地得到3位連接的三糖，將三糖的苄叉基水解，即得到4，6位為游離羥基的三糖受體，如下反應式所示 五糖供體4與三糖受體12選擇性地在12的6位縮合，得到保護的八糖13，用鹼脫掉乙醯基即得到八糖15，如下反應式所示 下面結合實施例對本發明進行詳細的說明。
(1)保護的甘露核心五糖3的合成將1，2乙叉基甘露糖1(1.03克，5毫摩爾)，α1→2連接的甘露雙糖三氯乙醯亞胺酯的糖基供體2(11.5克，10毫摩爾)溶於100毫升二氯甲烷中，冷卻至-10℃，在攪拌下加入三甲基矽三氟甲磺酸酯100微升，然後使反應物自然升溫到室溫，五小時後加200微升三乙胺結束反應，減壓下蒸掉溶劑，柱層析分離後得中間物3(16.5克，77％)。m.p141-144℃；[α]D-11.5°(c1.1，CHCl3)；1H NMRδ 7.98-7.25(m，60H，Bz-H)，5.67(dd，1H，J 3.0Hz，J 1.7Hz)，5.64(dd，1H，J 3.1Hz，J 1.7Hz)，5.53(s，1H)，5.26(q，1H，CH3-CH)，5.20(s，1H)，5.12(d，1H，J 1.6Hz)，5.08(d，1H，J 1.7Hz)，5.05(d，1H，J 1.7Hz)，2.01(s，3H，CH3CO)，2.00(s，3H，CH3CO)，1.50(d，3H，CH3-CH).(2)甘露五糖供體4的合成將保護的甘露核心五糖3(2186毫克，1毫摩爾)溶於10毫升90％的三氟乙酸中，在室溫下攪拌，用TLC(乙酸乙酯/石油醚1/1)監測反應，反應完成後減壓下蒸掉溶劑，柱層析分離後得中間物，將此中間物溶於10毫升吡啶中，加入乙酸酐5毫升，五小時後反應完成，減壓下蒸掉溶劑，兩步反應後得到的全醯化的產品2201毫克，收率94％，將此產品(2244毫克，1毫摩爾)溶於二氯甲烷(20毫升)中，加入CCl3CN(0.1毫升，1毫摩爾)及DBU(14微升，0.1毫摩爾)反應混合物攪拌2小時後完成，濃縮混合物，用柱層析法精製(2/1石油醚/乙酸乙酯)，得到結晶的五糖供體4(2150毫克，90％)M.p.135-137℃； (c＝1.3 in CHCl3)；1H NMR δ＝(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)9.03，8.10-7.26，6.35，6.05，5.96，5.91，5.88，5.85，5.80，5.74，5.68-5.66，5.64，5.45，5.43，5.17，5.09，4.61-4.43，4.33，4.30，4.22-4.18，3.89-3.84，3.59-3.56，2.26，2.10，2.02，2.00；元素分析計算值(％)C124H108O42NCl3C 62.30，H 4.52；實測值 C 62.45，H 4.40.(3)3，4，6-三-O-苯甲醯基-β-D-甘露糖1，2-烯丙基原酸酯(7)將2，3，4，6-四-O-乙醯基-α-D-甘露糖溴(8.22克，20毫摩爾)加入到烯丙醇(40mL)中，在攪拌下加入2，4-二甲基吡啶(2.3毫升，20毫摩爾)，反應在室溫下進行，用TLC檢測(1∶1石油醚/乙酸乙酯)。反應完成後，減壓下濃縮，殘餘物懸浮於無水甲醇中MeOH(20毫升)，加入甲醇鈉的甲醇溶液(2摩爾，0.4毫升)，混合物攪拌過夜，反應完成。將反應液減壓濃縮，殘餘物用柱層析分離，得到粉末狀6(4.72克，90％)。將6溶於吡啶(30毫升)中，在攪拌下滴加苯甲醯氯(8.2毫升，70毫摩爾)。三小時後反應完成，用常規方法對反應液進行後處理，用柱層析(3/1石油醚/乙酸乙酯)精製。得到結晶的化合物7(10.33克，～100％)。(4)2-O-乙醯基-3，4，6-三-O-苯甲醯基-α-D-甘露糖-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲醯基-α-D-甘露糖烯丙基苷(8)化合物7在高真空下乾燥二小時，然後溶於二氯甲烷(80毫升)中，在-42℃氮氣保護下滴加TMSOTf(100微升)，2小時後，TLC(3/1石油醚/乙酸乙酯)指示反應完成。用三乙胺中和，減壓濃縮，柱層析精製得到固體的8(6.72克，66％).m.p 148-150℃；[α]D+3.0°(c 1.3，CHCl3)；1HNMR δ 8.07-7.33，5.99，5.90-5.85，5.70，5.28-5.18，5.16，5.11，4.61-4.47，4.39-4.36，4.15-4.13，3.95-3.92，2.03.計算值C59H52O18C，67.56；H，4.96實測值C，67.60；H，4.92.(5)2-O-乙醯基-3，4，6-三-O-苯甲醯基-α-D-甘露糖-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲醯基-α-D-甘露糖三氯乙醯亞胺酯(2)將化合物8(524毫克，0.5毫摩爾)加入到含乙酸鈉(293毫克，3毫摩爾)的90％乙酸(10毫升)中，再加入PdCl2(89毫克，0.5毫摩爾)，混合物在室溫下攪拌12小時，TLC(2/1石油醚/乙酸乙酯)指示反應完成，用二氯甲烷(30毫升)稀釋，用水、飽和碳酸氫納溶液洗滌，減壓濃縮有機相，用柱層析精製，得到2-O-乙醯基-3，4，6-三-O-苯甲醯基-α-D-甘露糖-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲醯基-α-D-甘露糖(456毫克)，將其溶於二氯甲烷(20毫升)中，加入CCl3CN(0.1毫升，2毫摩爾)及DBU(14微升，0.18毫摩爾)，反應6小時後完成，減壓下濃縮反應液，柱層析精製得到結晶的化合物2(473毫克，兩步收率90％)，m.p 139-142℃；[α]D-1.5°(c 1.1，CHCl3)；1H NMR δ 8.64，8.02-7.26，6.59，6.09，5.95-5.87，5.70，5.20，4.68-4.48，2.03。計算值C58H48O18Cl3NC，60.31；H，4.16.實測值C，60.34；H，4.15.(6)三糖受體12的製備雙糖供體2(1153毫克，1毫摩爾)與單糖受體9(308毫克，1毫摩爾)在真空下乾燥2小時，然後溶於二氯甲烷(50毫升)中，在-20℃，攪拌下加入TMSOTf(15微升，0.08毫摩爾)，反應在攪拌下進行2小時，溫度逐步升至室溫，用三乙胺終止反應，濃縮反應物用柱層析法精製(1∶1.5石油醚-乙酸乙酯)得到結晶的三糖10(1194毫克，92％)；M.p.135-137℃； (c＝0.9 in CHCl3)；13C NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝169.29，166.48，165.89，165.69，165.67，165.45，165.07，101.92，99.95，99.39，98.87，78.66，75.84，73.32，71.28，70.51，69.83，69.46，69.44，68.91，67.89，66.85，64.14，63.40，62.77，55.01；1H NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝8.06-7.32，5.95-5.85，5.83，5.77，5.61，5.56，5.40，5.30，5.02，4.91，4.90，4.60-4.50，4.47，4.36，4.29-4.17，4.15-4.05，4.02-3.95，3.88，3.82，2.01；將10(1298毫克，1毫摩爾)溶於吡啶(30毫升)中，加入乙酸酐(1毫升，10毫摩爾)，反應物在攪拌下過夜，TLC(1.5∶1石油醚-乙酸乙酯)指示反應完成，用常規方法處理反應物，用柱層析法精製(2∶1石油醚-乙酸乙酯)後，定量地得到結晶的三糖11；M.p.130-132℃； (c＝0.9 in CHCl3)；元素分析計算值(％)C74H68O24(1340)C 66.27，H 5.07；實測值C 66.40，H 5.00.將11(1340毫克，1毫摩爾)溶於甲醇(50毫升)中，加入乙醯氯(0.05毫升，0.7毫摩爾)反應物在室溫下攪拌過夜後完成，產物濃縮後用柱層析精製(1.5∶1石油醚-乙酸乙酯)後得到固體的三糖受體12(1127毫克，90％)； (c＝1.3 in CHCl3)；13C NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝170.18，169.84，166.28，166.09，165.49，165.47，164.44，164.42，99.97，99.69，97.97，78.60，75.64，72.37，71.20，70.83，69.54，69.48，69.10，68.97，68.44，68.07，67.17，64.92，64.89，62.30；1H NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝8.06-7.26，5.96，5.90-5.78，5.75，5.65，5.62，5.38，5.28，5.20，5.12，4.84，4.64-4.38，4.18，4.14，4.06，3.95，3.78，3.70，2.22，2.02；元素分析計算值(％)C67H64O24(1252)C 64.22，H 5.11；實測值C 63.96，H 5.14.(7)八糖15的製備將五糖供體4(1193毫克，0.5毫摩爾)及三糖受體12(626毫克，0.5毫摩爾)在真空下乾燥2小時，然後溶於二氯甲烷(30毫升)中，在-20℃下加入TMSOTf(7.5微升，0.08毫摩爾)，反應在攪拌下進行3小時，溫度逐步升至室溫，用三乙胺中和，濃縮反應物，將得到的漿狀物用柱層析法精製(1∶1石油醚-乙酸乙酯)，得到八糖13(1426毫克，82％)； -18.0°(c＝0.9 in CHCl3)；質譜MALDI-TOF分析計算值C189H170O653478.99[M].實測值3479[M]；元素分析計算值(％)C189H170O65(3479)C 65.21，H 4.89；實測值C 65.36，H 4.76.將13(1043毫克，0.3毫摩爾)溶於吡啶(20毫升)中，加入乙酸酐(1毫升，10毫摩爾)，在室溫，攪拌下5小時，反應完成，用常規方法處理反應液，濃縮有機相，用柱層析法精製(1.5∶1石油醚-乙酸乙酯)，定量地得到固體的14 (c＝1.0 in CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝8.02-7.26，6.31，6.01，5.98-5.83，5.78-5.70，5.67-5.60，5.56，5.48，5.45-5.30，5.23，5.20，5.12，5.10，5.08，5.03，4.95，4.92，4.70-4.42，4.25，4.20，3.87-3.76，3.74，3.60-3.45，2.28，2.23，2.08，2.01，2.00，2.09，1.96；質譜MALDI-TOF計算值C191H172O663521.01[M].實測值3521[M]；將14(704毫克，0.2毫摩爾)溶於用氨飽和的甲醇(4毫升)中，室溫下反應7天後，將反應物濃縮，用Sephadex LH-20(甲醇)精製後得到獎狀的游離的八糖15(230毫克，85％)；13C NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝136.88，118.54，101.98，101.86，101.86，100.56，100.36，100.28，98.99，97.60，78.44，78.38，72.75，72.26，70.71，70.22，69.85，69.58，69.50，69.08，66.42，66.32，66.24，66.03，65.24，65.03，64.65，60.80，60.68，60.48，59.96，58.23，1H NMR(400MHz，D2O，25℃，TMS)δ＝5.87，5.31，5.28，5.25，5.20，5.08，4.95，4.80，4.60，4.05-3.53；質譜MALDI-TOF計算值C51H86O411354.46[M].實測值1354.66[M].
權利要求
1.一種以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲醯基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(9)為起始物的簡易甘露八糖合成法。其特徵在於以甘露糖苷1為糖基受體，以α1→2連接的甘露雙糖三氯乙醯亞胺酯2為糖基供體，一步法縮合成3，6位連接的甘露五糖3，脫掉乙叉基再乙醯化，選擇性地脫掉1位乙醯基然後用三氯乙睛活化即得到五糖供體4。如下反應式所示 Bz＝苯甲醯基，Ac＝乙醯基
2.一種以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲醯基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖(9)烯丙基苷為起始物的簡易甘露八糖合成法。其特徵在於α1→2連接的甘露雙糖三氯乙醯亞胺酯的糖基供體2由甘露糖原酸酯7縮合，得到α1→2連接的甘露雙糖8，脫掉烯丙基後再用三氯乙睛活化1位即得到2，而糖的原酸酯7由乙醯基溴代甘露糖5製備，如下反應式所示 Bz＝苯甲醯基，Ac＝乙醯基All＝烯丙基
3.一種以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲醯基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(9)為起始物的簡易甘露八糖合成法。其特徵在於使4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷與雙糖供體2縮合，選擇性地得到3位連接的三糖，將三糖的苄叉基水解，即得到4，6位為游離羥基的三糖受體，如下反應式所示
4.一種以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲醯基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(9)為起始物的簡易甘露八糖合成法。其特徵在於五糖供體4與三糖受體12選擇性地在12的6位縮合，得到保護的八糖13，用鹼脫掉乙醯基即得到八糖15，如下反應式所示
全文摘要
本發明涉及生物體內起重要生物學作用的甘露八糖α－D－甘露糖－(1→2)－α－D－甘露糖－(1→3)－{α－D－甘露糖－(1→2)－α－D－甘露糖－(1→3)－[－α－D－甘露糖－(1→2)－α－D－甘露糖－(1→6)]－α－D－甘露糖－(1→6)}－a－D－甘露糖的簡便化學合成法。
文檔編號C08B37/00GK1381503SQ0111076
公開日2002年11月27日 申請日期2001年4月20日 優先權日2001年4月20日
發明者孔繁祚, 朱玉亮 申請人:中國科學院生態環境研究中心