一種腦膜炎球菌抗原組合及其應用的製作方法
2023-05-29 15:48:46 1
一種腦膜炎球菌抗原組合及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種新的腦膜炎球菌的抗原組合及其應用。具體地，所述的抗原組合包括：由fHbp?V1變異型蛋白、fHbp?V2變異型蛋白、和NHBA蛋白。實驗證明，採用本發明抗原組合製備的疫苗能夠具有明顯的協同效應，且表現出良好的廣譜抗腦膜炎球菌能力。
【專利說明】一種腦膜炎球菌抗原組合及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及疫苗領域，尤其涉及腦膜炎球菌重組蛋白疫苗組分及其組合。
【背景技術】
[0002]細菌性腦膜炎嚴重地威脅人類的健康，全球每年死亡病例估計有17萬例，而奈瑟腦膜炎球菌是引起細菌性腦膜炎的三種主要病原微生物之一，也是唯一引起流行性腦膜炎(流腦)的致病菌。全球流腦的平均發病率為1-10/10萬，病死率10%左右，20%以上患者會留下永久的中樞神經系統損傷。
[0003]根據莢膜多糖化學結構的不同，腦膜炎球菌可分為13個血清群，主要的致病菌群是A、B、C、Y和W135群，可引起95%以上的病例。其他如29E、X等血清群也可致病，但病例數較少，最近在非洲發生小規模的X群流腦流行，中國也發現X群病例。在歐洲、美洲和大洋洲等地區，由B群菌株引起的腦膜炎超過1/3，在應用C群腦膜炎球菌多糖結合疫苗的國家，由B群菌株引起的病例超過了 2/3,甚至達到90% (Lucidarme J,等.J Clin Microb11.2009,47(11):3577-3585.) ο在中國，通常認為A群和C群是最主要的致病群。但是近年來，從病人和健康人中分離的腦膜炎球菌菌株中，B群為主要致病群的菌株約佔1/3。
[0004]對於A、C、W135和Y群來說，用莢膜多糖及莢膜多糖_蛋白結合物製成的多糖疫苗和多糖結合疫苗可以預防。而B群多糖結構與人體組織成分有同源性，不能製成疫苗。
[0005]目前，只有幾種外膜囊泡(OMV)疫苗在局部地區使用，這種疫苗的主要成分是I類外膜蛋白PorA。該蛋白是腦膜炎球菌亞型分類依據，具有高度變異性，因此OMV疫苗僅能用於預防與PorA同亞型的菌株。
[0006]隨著基因組學、蛋白組學、逆向疫苗學等的發展，一系列位於細菌表面、能誘導殺菌抗體的疫苗候選蛋白被篩選鑑定出來，主要包括:1類外膜蛋白PorA、奈瑟菌黏附素(NadA)、H 因子結合蛋白(fHbp，其它名稱 GNA1870、LP2086、0RF2086、NMB1870、fHBP，具有變異型V1、V2和V3)、肝素結合蛋白(NHBA，其它名稱GNA2132)、奈瑟菌表面蛋白A(NspA)等。
[0007]由於腦膜炎球菌表面蛋白存在多樣性和變異性，往往多抗原的組合才能達到較好、較廣的保護效果，試驗證據表明，多抗原的組合能發揮互補和協同作用。2013年I月，Novartis公司開發的一種B群腦膜炎球菌疫苗被歐盟批准上市，其成分為重組的GNA1870-fHbp (變異型VI)融合蛋白、NadA-3、NHBA_GNA2131融合蛋白，以及從NZ98/254菌株製備的OMV (主要成分為PorAl.4)。然而，多抗原疫苗中的各種抗原之間是否存在效價的互相影響以及是否會造成副作用的增大卻是疫苗製備過程中潛在的風險。
[0008]因此，基於腦膜炎球菌表面蛋白的多樣性和變異性，如何選擇合適的蛋白成為研製B群腦膜炎球菌疫苗，乃至通用型腦膜炎球菌疫苗的挑戰。故本領域迫切需要開發一種有效且具有一定覆蓋面的B群疫苗。
【發明內容】
[0009]本發明提供了一種獨特的適用於B群腦膜炎的組合疫苗，其能誘導針對多種腦膜炎球菌的殺菌抗體。
[0010]本發明的第一方面，提供了一種抗原組合，所述的抗原組合包括:
[0011]H 因子結合蛋白變異型 I (factor H binding protein, variantl, fHbp Vl 變異型蛋白)、H因子結合蛋白變異型2 (factor H binding protein, variant2, fHbp V2變異型蛋白)、和肝素結合蛋白(Neisserial Heparin Binding Antigen, NHBA 蛋白)。
[0012]在另一優選例中，所述的組合還包括將fHbp Vl變異型蛋白、fHbp V2變異型蛋白或NHBA蛋白的胺基酸序列分別經過一個或幾個胺基酸的取代、刪除或添加而形成的衍生蛋白的組合，且所述的衍生蛋白的組合具有激活機體對腦膜炎球菌B群產生免疫應答活性的功能。
[0013]在另一優選例中，所述的fHbp Vl變異型蛋白、fHbp V2變異型蛋白、和NHBA蛋白分別包括野生型和突變型。
[0014]在另一優選例中，所述的fHbp Vl變異型蛋白(如SEQ ID N0.: 1-3)第6-113位胺基酸序列的同源性≥95%。
[0015]在另一優選例中，所述的fHbp V2變異型蛋白(如SEQ ID N0.:4_6)第6-145位胺基酸序列的同源性≥95%。
[0016]在另一優選例中，所述的NHBA蛋白(如SEQ ID N0.: 7-9)第27_87位胺基酸序列的同源性≥85%。
[0017]在另一優選例中，所述的抗原組合中，fHbp Vl變異型蛋白的序列如SEQ IDN0.: 1-3所示；和/或
[0018]所述fHbp V2變異型蛋白的序列如SEQ ID N0.:4_6所示；和/或
[0019]所述NHBA蛋白的序列如SEQ ID N0.: 7-9所示。
[0020]在另一優選例中，所述抗原組合中的蛋白均來自腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)。
[0021]本發明第二方面，提供了一種分離的多核苷酸組合，所述的多核苷酸組合中的多核苷酸分別編碼本發明第一方面所述抗原組合中的抗原。
[0022]在另一優選例中，所述的多核苷酸組合中的多核苷酸序列如SEQ ID N0.:10_18所示，分別編碼SEQ ID N0.:1-9的蛋白。
[0023]本發明第三方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發明第二方面所述的多核苷酸組合中的多核苷酸。
[0024]在另一優選例中，所述的載體為表達載體。
[0025]在另一優選例中，所述的載體中可含有一個或多個本發明第二方面所述多核苷酸組合中的多核苷酸。
[0026]本發明第四方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有本發明第三方面所述的載體，或所述的宿主細胞的染色體整合有本發明第二方面所述的多核苷酸組合。
[0027]本發明第五方面，提供了一種獲得本發明第一方面所述抗原組合的方法，培養本發明第四方面所述的宿主細胞，從而獲得本發明第一方面所述的抗原組合。
[0028]本發明第六方面，提供了一種本發明第一方面所述抗原組合的用途，用於製備預防腦膜炎球菌性腦膜炎的疫苗組合物。
[0029] 在另一優選例中，所述的疫苗組合物包括本發明第一方面所述的抗原組合，以及疫苗學上可接受的載體。
[0030]在另一優選例中，所述的抗原組合還可用於作為載體蛋白用於製備多糖-蛋白結合疫苗。
[0031]在另一優選例中，所述多糖可以來自奈瑟腦膜炎球菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、傷寒沙門菌、A群鏈球菌、B群鏈球菌；多糖可以來自於莢膜多糖、脂多糖、脂寡糖。
[0032]本發明第七方面，提供了一種疫苗組合物，所述的疫苗組合物包括本發明第一方面所述的抗原組合，和疫苗學上可接受的載體。
[0033]在另一優選例中，所述的疫苗學上可接受的載體包括鋁佐劑、MF59、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、CpG佐劑、卡介菌核糖核酸、單磷醯脂A。
[0034]在另一優選例中，所述的疫苗組合物還可以用於製備聯合疫苗。
[0035]在另一優選例中，所述的聯合疫苗還包括A群、C群、Y群或W135群疫苗，Hib結合疫苗、肺炎球菌結合疫苗、百日咳白喉破傷風疫苗、傷寒Vi多糖結合疫苗、副傷寒多糖結合疫苗，組成多價腦膜炎球菌疫苗和/或聯合疫苗。
[0036]在另一優選例中，所述的疫苗組合物還可以包含NadA、NspA、FetA。
[0037]在另一優選例中，所述的疫苗組合物，fHbp Vl變異型蛋白、fHbp V2變異型蛋白、NHBA蛋白之間的比例為1: (0.5-2): (0.5_2)，優選為1:1:1(按有效成分的重量計)
[0038]本發明第八方面，提供了一種製備本發明第七方面所述疫苗組合物的方法，包括步驟:將本發明第一方面所述的抗原組合與疫苗學上可接受的載體混合，從而獲得本發明第七方面所述的疫苗組合物。
[0039]在另一優選例中，所述的抗原組合中的抗原通過基因重組或化學合成獲得。
[0040]本發明第九方面，提供了一種預防腦膜炎球菌性腦膜炎的方法，向所需要的對象施用本發明疫苗組合物。
[0041 ] 在另一優選例中，所述的需要的對象包括哺乳動物，較佳地，為人、小鼠、大鼠、兔。
[0042]應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0043]圖1顯示了 fHbp-Ι、fHbp-2和NHBA等3種蛋白基因的PCR擴增產物電泳圖譜。
[0044]圖2顯示了重組表達fHbp-l、fHbp_2和NHBA3種蛋白的重組質粒的雙酶切鑑定圖
-1'TfeP曰。
[0045]圖3顯示了純化的重組fHbp-Ι、fHbp-2和NHBA蛋白SDS-PAGE電泳圖譜。
[0046]圖4顯示了重組fHbp-Ι、fHbp-2和NHBA蛋白兔血清特異性抗體測定結果。
[0047]圖5顯示了重組fHbp-Ι、fHbp-2和NHBA免疫兔血清與細菌結合的FACS試驗結果(紫色填充的區域為陰性對照，未填充的紅色/藍色曲線為免疫血清檢測結果)。
[0048]圖6顯示了重組fHbp-la/b、fHbp-2a/b、NHBA_a/b、及其組合免疫血清對細菌的殺囷力試驗結果。
[0049]圖 7 顯示了重組 fHbp-lc、fHbp_2c、NHBA-c、fHbp-lc+fHbp-2c+NHBA_c 免疫兔血清在乳鼠被動免疫保護試驗中的結果。
【具體實施方式】
[0050]本發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發現了，將來自於腦膜炎球菌的fHbp蛋白的V1、V2變異型以及NHBA蛋白共同組合，組成的抗原能夠有效地在體內形成抗腦膜炎球菌B群的免疫，且這種免疫效果呈明顯的協同效應。此外，實驗證明，將這三種蛋白共同組合使用形成的疫苗能夠具有良好的菌株覆蓋能力，且鑑於腦膜炎球菌不具備群特異性，本發明疫苗組合物也可在一定程度上覆蓋到A群和C群為主要致病群的腦膜炎球菌中，因此，本發明疫苗組合物可用作廣譜的抗腦膜炎球菌疫苗。在此基礎上，完成了本發明。
[0051]fHbp 蛋白
[0052]fHbp是一種膜表面脂蛋白，許多腦膜炎球菌的菌株都帶有其基因，也發現不攜帶該基因的菌株(Lucidarme J,等.Clin.Vaccine Immunol.2011，18 (6): 1002-1014.)。根據胺基酸序列的不同，該蛋白可以分為3種變異型(VI變異型、V2變異型和V3變異型)，其中V2變異型與V3變異型具有一定的交叉保護作用，而它們與Vl變異型之間交叉保護作用弱。
[0053]變異型1、變異型2和變異型3基因分別編碼280個左右胺基酸殘基。相同變異型的fHbp蛋白的胺基酸同源性最低可達約90%,不同變異型的fHbp蛋白之間的胺基酸同源性可低至62%。
[0054]可用於本發明的fHbp Vl變異型蛋白沒有特別限制，可以為任何野生型或突變型的fHbpVl變異型蛋白。優選地，可用於本發明抗原組合或疫苗組合的fHbp蛋白中，fHbpVl變異型的序列可選自SEQ ID N0.: 1-3，也可包括將SEQID N0.: 1_3進行一個或幾個胺基酸添加、刪除或取代的胺基酸序列，更優選地，可以是與野生型fHbp Vl變異型蛋白(如SEQID N0.:1-3序列)的第6-113位胺基酸同源性保持在90%以上，較佳地為95%以上的蛋白的序列。
[0055]可用於本發明的fHbp V2變異型蛋白沒有特別限制，可以為任何野生型或突變型的fHbpV2變異型蛋白。優選地，可用於本發明抗原組合或疫苗組合的fHbp蛋白中，fHbpV2變異型的序列可選自SEQ ID N0.:4_6，也可包括將SEQ ID N0.:4_6進行一個或幾個胺基酸添加、刪除或取代的胺基酸序列，更優選地，可以是與野生型fHbp V2變異型蛋白(如SEQ ID N0.:4-6序列)的第6-145位胺基酸同源性保持在90%以上，較佳地為95%以上的蛋白的序列。
[0056]NHBA 蛋白
[0057]NHBA是奈瑟菌屬特有的一種脂蛋白，幾乎在所有的菌株上表達，但NHBA蛋白胺基酸序列具有一定的變異性，因此針對NHBA的單一疫苗往往無法覆蓋大範圍的菌株。
[0058]NHBA基因編碼的胺基酸殘基數約420-500個，不同的NHBA蛋白之間，除單個或多個位點的胺基酸變異外，還存在單個胺基酸或短肽的插入或缺失。不同的NHBA蛋白的胺基酸同源性可低至60%。
[0059]可用於本發明的NHBA沒有特別限制，可以為任何野生型或突變型的NHBA變異型蛋白。由於野生型NHBA蛋白的同源性較低，因此一般與SEQ ID N0.: 7_9所示的NHBA蛋白同源性大於60 %，優選大於70 %，更優選地大於80 %的突變型NHBA也可用於本發明的抗原組合或疫苗組合。更優選地，可以是與野生型NHBA蛋白(如SEQ ID N0.:7_9序列)的第27-87位胺基酸同源性保持在85%以上，較佳地為90%以上的蛋白的序列。
[0060]抗原組合
[0061]本發明同時提供了一種含有多蛋白的抗原組合。其中，所述的抗原組合中的蛋白來自於腦膜炎球菌。
[0062]如本文所用，術語「本發明蛋白」指的是本發明抗原組合中一種或多種的蛋白總稱。
[0063]如本文所用，術語「抗原」是指能夠刺激機體產生(特異性)免疫應答，並能與免疫應答產物抗體和致敏淋巴細胞在體外結合，發生免疫效應(特異性反應)的物質。抗原的基本特性有兩種，一是誘導免疫應答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應答的產物發生反應，也就是抗原性。
[0064]如本文所用，術語「fHbp Vl變異型蛋白、fHbp V2變異型蛋白和NHBA蛋白的組合」、「抗原組合」、「本發明蛋白組合」、「本發明組合」可互換使用，指的是將本發明蛋白或其衍生蛋白三者共同組合形成的抗原混合物。
[0065]如本文所用，術語「fHbpVl變異型」、「fHbp變異型1」、「變異型I」可互換使用，指的是腦膜炎球菌B群的fHbp蛋白的Vl變異型。術語「fHbpV2變異型」、「fHbp變異型2」、「變異型2」可互換使用，指的是腦膜炎球菌B群的fHbp蛋白的V2變異型。
[0066]此外，所述抗原組合還可以是以下序列構成的組合:即具有激活機體對腦膜炎球菌B群產生免疫應答活性的、SEQ ID NO:1-9所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於):1-5個( 通常為1-4個，更佳地1-3個，最佳地1-2個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個(通常為5個以內，較佳地為3-4個以內，更佳地為1-2個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的結構和功能。
[0067]本發明還包括所述的抗原組合的活性片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」、「衍生蛋白」和「類似物」是指基本上保持激活機體對腦膜炎球菌B群產生免疫應答活性的蛋白。本發明的蛋白的片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或幾個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)本發明蛋白與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合於此多肽序列而形成的多肽(與前導序列、分泌序列或6His等標籤序列融合而形成的衍生蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物可以是野生型的，也可以是突變型的，這些均屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
[0068]一類優選的活性衍生物指與SEQ ID N0.: 1-9的胺基酸序列分別相比，有至多5個，較佳地至多3-4個，更佳地至多1-2個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。
[0069]表1
[0070]
最初的殘基~I代表性的取代I優選的取代
Ala(A)Val ；Leu ；IleVal
【權利要求】
1.一種抗原組合，其特徵在於，所述的抗原組合包括: H 因子結合蛋白變異型 I (factor H binding protein, variantl, fHbp Vl 變異型蛋白)、H因子結合蛋白變異型2 (factor H binding protein, variant2, fHbp V2變異型蛋白)、和肝素結合蛋白(Neisserial Heparin Binding Antigen, NHBA 蛋白)。
2.如權利要求1所述的抗原組合，所述的抗原組合中，fHbpVl變異型蛋白的序列如SEQ ID N0.: 1-3 所示；和 / 或 所述fHbp V2變異型蛋白的序列如SEQ ID N0.:4_6所示；和/或 所述NHBA蛋白的序列如SEQ ID N0.:7_9所示。
3.如權利要求1所述的抗原組合，其特徵在於，所述抗原組合中的蛋白均來自腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)。
4.一種分離的多核苷酸組合，其特徵在於，所述的多核苷酸組合中的多核苷酸分別編碼權利要求1所述抗原組合中的抗原。
5.一種載體，其特徵在於，所述的載體含有權利要求4所述的多核苷酸組合中的多核苷酸。
6.一種宿主細胞，其特徵在於，所述的宿主細胞含有權利要求5所述的載體，或所述的宿主細胞的染色體整合有權利要求3所述的多核苷酸組合。
7.一種獲得權利要求1所述抗原組合的方法，其特徵在於，培養權利要求6所述的宿主細胞，從而獲得權利要求1所述的抗原組合。
8.權利要求1所述抗原組合的用途，其特徵在於，用於製備預防腦膜炎球菌性腦膜炎的疫苗組合物。
9.一種疫苗組合物，其特徵在於，所述的疫苗組合物包括權利要求1所述的抗原組合，和疫苗學上可接受的載體。
10.一種製備權利要求8所述疫苗組合物的方法，其特徵在於，包括步驟:將權利要求1所述的抗原組合與疫苗學上可接受的載體混合，從而獲得權利要求8所述的疫苗組合物。
【文檔編號】C12N15/70GK104072590SQ201410290161
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月24日 優先權日:2014年6月24日
【發明者】朱為, 吳根鵬, 袁萍, 黃幗英, 王曉, 畢慧, 榮家康 申請人:上海生物製品研究所有限責任公司