腹瀉性貝類毒素檢測方法
2023-05-29 20:35:26 2
專利名稱：腹瀉性貝類毒素檢測方法
技術領域：
本發明屬於生物檢測方法領域，尤其是涉及一種有著較高靈敏度的腹瀉性貝類毒 素檢測方法。
背景技術：
當前，我國用於腹瀉性貝類毒素(diarrhetic shellfish poisoning，DSP)的檢 測方法主要有小鼠生物法及酶聯免疫吸附檢測法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)。小鼠生物法的檢測原理貝類樣品用丙酮、乙醚提取後，經減壓蒸乾，以吐 溫-60生理鹽水溶解後注射入小鼠腹腔，觀察小鼠存活情況，計算其毒力。ELISA的檢測原理測定的基礎是抗原抗體反應，微孔板包被有針對大田軟海綿 酸(okadaic acid, OA) (DSP的主要成分)抗體的捕捉抗體，加入標準或樣品溶液及OA酶標 記物，游離OA與OA酶標記物競爭OA抗體，同時OA抗體與捕捉抗體連接。洗滌後，將底物 和發色劑加入到孔中並且孵育。加入終止液後，在450nm波長下測定吸光度值。小鼠生物法是當前我國腹瀉性貝類毒素的標準檢測方法，但其不足之處顯而易 見，如(1)動物使用帶來的倫理問題，受到動物保護組織的強烈反對；(2)靈敏度低，可比 性和重複性差，檢測結果與小鼠的品系、體重及狀態等有關，難以形成統一的檢測標準；(3) 準確性差，該方法只能檢測出毒力的大小，無法確定毒素的成分和含量，容易因高濃度的鋅 或不飽和脂肪酸的存在導致假陽性；(4)樣品提取過程複雜。ELISA法主要存在以下不足(1)抗體往往只針對主要成分，其類似物可能會產生 交叉反應，從而出現假陽性或對毒性的估計不準確；(2)單克隆抗體的製備困難，試劑盒價 格昂貴；(3)我國目前尚無商品化ELISA試劑盒可售。
發明內容
本發明的目的在於提供一種基於細胞F-actin檢測的腹瀉性貝類毒素檢測方法， 解決現有技術存在的缺陷。為實現上述目的，本發明採用如下技術方案一種腹瀉性貝類毒素檢測方法，包括步驟A)研究腹瀉性貝類毒素的主要成分大田軟海綿酸(OA)的細胞毒性效應，通過 Cell Counting Kit_8試劑盒法、細胞形態學觀察法及流式細胞術等方法，從細胞增殖、細 胞凋亡等方面探討腹瀉性貝類毒素的主要成分大田軟海綿酸(OA)對HL-7702肝細胞毒性 效應； B)利用螢光染料鬼筆環肽能結合F-actin聚合體的原理，根據OA作用HL-7702肝 細胞的劑量_反應關係，選用不同濃度的OA染毒細胞，通過多功能酶標儀定量檢測發現OA 能明顯破壞HL-7702肝細胞的F-actin的聚合，從而建立OA誘導HL-7702肝細胞F-actin 解聚的標準曲線；
C)根據HL-7702肝細胞的F-actin解聚的標準曲線進行OA濃度的計算，初步建立 腹瀉性貝類毒素的細胞F-actin檢測法，確定可能的檢出限範圍；D)選擇與腹瀉性貝類毒素可能共存的三種成分麻痺性貝類毒素的主要成分石 房蛤毒素(saxitoxin，STX)、遺忘性貝類毒素的主要成分軟骨藻酸(domoic acid, DA)、 蝦夷扇貝毒素(yessotoxin, YTX)中的一種或者幾種，分別以不同濃度(5、10、20、40、80、 160nmol/L)作用HL-7702肝細胞，通過檢測其破壞HL-7702肝細胞F-actin聚合能力的大 小確定該方法測定OA含量的特異性；E)同步使用小鼠生物法、ELISA法及細胞F-actin檢測法對採集的貝類樣品分別 進行腹瀉性貝類毒素的檢測，並進行結果比對，確定細胞F-actin檢測法開展貝類樣品檢 測的實用性；F)對檢測樣品加標回收。更優的是所述步驟A)包括Al)待細胞生長至70-80%匯合度，用0. 125-0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化收集細 胞，離心後重懸使其密度達3-5 X IO5個/mL，接種l_2mL細胞懸液於事先鋪蓋玻片的6孔板 中，置於培養箱中培養；培養24h後，棄去培養基，分別使用5、10、20nmol/L OA染毒HL-7702 肝細胞，並設甲醇對照；OA染毒24h後，PBS洗滌2-3次，使用Oregon Green 5 Hphalloi din 螢光標記後，通過雷射共聚焦顯微鏡進行觀察螢光標記的F-actin ；A2)利用TECAN Infiite M1000多功能酶標儀定量檢測OA作用細胞後F-actin解 聚效應大小，建立OA誘導HL-7702肝細胞F-actin解聚的標準曲線。所述的步驟Al)染色包括All)加入 400-500 μ L3. 7% 甲醛溶液固定 IOmin ；Α12) PBS 洗滌 2-3 次，加入 600-800 μ L 0. 1% Triton X-100 透化 4_5min ；A13)PBS 洗滌 2-3 次，加入 PBS 稀釋的 Oregon Green 514phalloidin 儲液，避光 染色 15-20min ；A14)PBS洗滌2_3次，將6孔板中的蓋玻片取出倒扣於滴甘油封存液的載玻片上。更優的是所述的步驟Al)染色包括All)加入 400-500 μ L3. 7% 甲醛溶液固定 IOmin ；Α12) PBS 洗滌 2-3 次，加入 600-800 μ L0. 1% Triton X-100 透化 4_5min ；A13)PBS 洗滌 2-3 次，加入 PBS 稀釋的 Oregon Green 514phalloidin 儲液，避光 染色 15-20min ；A14)PBS洗滌2_3次，將6孔板中的蓋玻片取出倒扣於滴甘油封存液的載玻片上。更優的是所述步驟A2) OA誘導HL-7702肝細胞F-actin解聚的標準曲線A21)待細胞生長至70-80%匯合度，用0. 125-0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化收集細 胞，離心後重懸使其密度達3-5 X IO4個/mL，接種80-100 μ L細胞懸液於96孔黑板中，置於
培養箱中培養；Α22)培養24h後，棄去培養基，分別使用 1. 25,2. 5、5、10、20、40、80nmol/L OA染毒 HL-7702肝細胞，同時設甲醇對照和空白對照，各試驗組設6個復孔；A23) OA染毒24h後，PBS洗滌2_3次，對其進行染色，使用TECAN InfiniteMlOOO多功能酶標儀進行激發波長和發射波長的3D掃描；A24)可信區內選擇最大相對螢光單位值對應的波長即為最佳激發波長和最佳發 射波長，分別為Ex = 511nm, Em = 529nm ；最佳激發波長和最佳發射波長條件下，進行螢光 強度的掃描；A25)以OA濃度為橫坐標，解聚率為縱坐標，建立半對數坐標，建立OA誘導 HL-7702肝細胞F-actin解聚的標準曲線。更優的是所述的步驟B)中，使用甲醇溶劑進行貝類樣品的提取時甲醇的濃度為 1-4%。本發明與現有技術相比，存在如下優點和有益效果本發明建立的細胞F-actin檢測法與小鼠生物法相比(1)以細胞為實驗對象，避免了實驗動物的使用，符合3R原則；(2)靈敏度高；(3) 特異性較好；(4)重複性好；(5)樣品提取簡便，基質效應低。本發明建立的細胞F-actin檢測法與ELISA法相比(1)不存在抗體的交叉反應性，特異性較好；(2)檢測限達到2. 01 μ g/100g，低於 ELISA法的檢測限(10 μ g/100g)，靈敏度更高。
圖1為本發明實施例中不同濃度OA處理HL-7702肝細胞的雷射共聚焦顯微鏡掃 描結果；圖 Ι-a 為對照；圖 l_b 為 5nmol/L ；圖 l_c 為 IOnmol/L ；圖 l_d 為 20nmol/L ；圖2為本發明實施例中OA誘導HL-7702肝細胞F-actin解聚的標準曲線；圖3為本發明實施例中其他三種貝類毒素對HL-7702肝細胞F-actin檢測法的影 響示意圖；圖4為本發明實施例中甲醇對HL-7702肝細胞F-actin檢測法的影響。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明實施例1建立OA誘導HL-7702肝細胞F-actin解聚的標準曲線本實施例以HL-7702肝細胞為研究對象，使用OA標準品進行DSP細胞檢測方法的研究。使用Oregon Green 514phalloidin螢光標記F-actin後，使用雷射共聚焦顯微 鏡進行觀察。實驗方法待細胞生長至80%匯合度，0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化收集細胞，離心後重懸(密 度為5 X IO5個/mL)，接種2mL細胞懸液於事先鋪蓋玻片的6孔板中，置於培養箱中培養。培 養24h後，棄去培養基，分別使用5、10、20nmol/L OA染毒HL-7702肝細胞，設甲醇對照。OA 染毒24h後，PBS洗滌2次，參照Phallotoxins (Cat. No. 07465)的方法進行染色。主要步驟為(1)加入400 μ L3. 7%甲醛溶液固定IOmin ；(2) PBS 洗滌 2 次，加入 800 μ L0. 1% Triton X-100 透化 4min ；
(3)PBS 洗滌 2 次，加入 490 μ LPBS 及 10 μ LOregon Green 514phalloidin 儲液， 避光染色20min ；(4)PBS洗滌2次，將6孔板中的蓋玻片取出倒扣於滴90%甘油封存液的載玻片 上，使用雷射共聚焦顯微鏡進行觀察並成像。結果如圖1所示，Oregon Green 514phalloidin螢光標記的F-actin呈纖維狀， 各試驗組細胞均有纖維狀物質能顯示綠色螢光，但試驗組細胞隨著OA濃度的增加，綠色熒 光強度明顯減弱。由於Oregon Green 514phalloidin僅與聚合態的F-actin特異性結合， 因此在OA的作用下，細胞F-actin存在解聚現象。利用TECAN Infiite M1000多功能酶標儀定量檢測OA作用細胞後F-actin解聚 效應大小，建立用於檢測DSP的細胞F-actin檢測法。實驗方法待細胞生長至80%匯合度，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集細胞，離心後重懸 (密度為5 X IO4個/mL)，接種100 μ L細胞懸液於96孔黑板中，置於培養箱中培養。培養 24h後，棄去培養基，分別使用1. 25,2. 5、5、10、20、40、80nmol/L OA染毒HL-7702肝細胞， 同時設甲醇對照和空白對照，各試驗組為6個復孔。OA染毒24h後，PBS洗滌2次，參照 Phallotoxins (Cat. No. 07456)的方法進行染色。主要步驟為(1)加入100 μ L3. 7%甲醛溶液固定IOmin ；(2) PBS 洗滌 2 次，加入 200 μ L0. 1% Triton X-100 透化 4min ；(3) PBS洗滌 2 次，加入95μ LPBS及 5μ L Oregon Green 514phalloidin 儲液，避 光染色20min ；(4) PBS洗滌2次，TECAN Infinite M1000多功能酶標儀進行激發波長和發射波長 的3D掃描；(5)最佳激發波長和最佳發射波長條件下，進行螢光強度的掃描。實驗結果TECAN Infinite M1000多功能酶標儀進行激發波長和發射波長的3D掃描，可信區 內選擇最大相對螢光單位值對應的波長即為最佳激發波長和最佳發射波長(Ex = 511nm, Em = 529nm)。以OA濃度為橫坐標，解聚率為縱坐標，建立半對數坐標，如圖2所示。從圖 中可看出，OA可明顯導致HL-7702細胞F-actin的解聚，且解聚率與OA濃度在2. 5 40nM 範圍內具有線性關係(R2 = 0. 993)。SPSS 13. 0統計學軟體進行單因素方差分析，OA濃度 低至1. 25nM時，與對照組相比，差異不具有統計學意義(P > 0. 05)。表1不同濃度OA對螢光強度值的影響
權利要求
一種腹瀉性貝類毒素檢測方法，包括步驟A)培養人HL 7702肝細胞，選用不同濃度的大田軟海綿酸(okadaic acid，OA)染毒細胞，檢測OA作用細胞後F 肌動蛋白(F actin)解聚效應大小，從而建立OA誘導HL 7702肝細胞F actin解聚的標準曲線；B)根據HL 7702肝細胞的F actin解聚的標準曲線進行OA濃度的計算，建立腹瀉性貝類毒素的細胞F actin檢測方法，確定可能的檢出限範圍；C)選擇與腹瀉性貝類毒素可能共存的成分石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、軟骨藻酸(domoic acid，DA)、蝦夷扇貝毒素(yessotoxin，YTX)中的一種或幾種，分別以不同濃度作用HL 7702肝細胞，通過檢測其破壞HL 7702肝細胞F actin聚合能力的大小確定該方法測定OA含量的特異性。
2.如權利要求1所述的腹瀉性貝類毒素檢測檢測方法，還包括步驟D)同步使用小鼠生物法、ELISA法及細胞F-actin檢測法對採集的貝類樣品分別進行 腹瀉性貝類毒素檢測，並進行結果比對；F)對檢測樣品加標回收。
3.如權利要求1或者2所述的腹瀉性貝類毒素檢測方法，其特徵是所述步驟C)選用 不同濃度石房蛤毒素(saxitoxin, STX)、(domoic acid, DA)、蝦夷扇貝毒素(yessotoxin, YTX)中的一種或幾種濃度分別為5、10、20、40、80、160nmol/L。
4.如權利要求1 3任一項所述的腹瀉性貝類毒素檢測方法，其特徵是所述步驟A)包括Al)待細胞生長至70-80%匯合度，用0. 125-0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化收集細胞， 離心後重懸使其密度達3-5 X IO5個/mL，接種l_2mL細胞懸液於事先鋪蓋玻片的6孔板 中，置於培養箱中培養；培養18_24h後，棄去培養基，分別使用5、10、20nmol/L OA染毒 HL-7702肝細胞，並設甲醇對照；OA染毒18_24h後，PBS洗滌2_3次，使用Oregon Green 514phalloidin螢光標記後，通過雷射共聚焦顯微鏡觀察螢光標記的F-actin ；A2)利用TECAN Infiite M1000多功能酶標儀定量檢測OA作用細胞後F-actin解聚效 應大小，建立OA誘導HL-7702肝細胞F-actin解聚的標準曲線。
5.如權利要求4所述的腹瀉性貝類毒素檢測方法，其特徵是所述的步驟Al)染色包括All)加入400-500 μ L3. 7%甲醛溶液固定IOmin ；Α12) PBS 洗滌 2-3 次，加入 600-800 μ L0. 1% Triton X-100 透化 4_5min ；A13)PBS洗滌2-3次，加入PBS稀釋的Oregon Green 514phalloidin儲液，避光染色 15-20min ；A14)PBS洗滌2-3次，將6孔板中的蓋玻片取出倒扣於滴甘油封存液的載玻片上。
6.如權利要求4所述的腹瀉性貝類毒素檢測方法，其特徵是所述步驟A2)0A誘導 HL-7702肝細胞F-actin解聚的標準曲線A21)待細胞生長至70-80%匯合度，用0. 125-0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化收集細胞，離 心後重懸使其密度達3-5 X IO4個/mL，接種80-100 μ L細胞懸液於96孔黑板中，置於培養 箱中培養；Α22)培養24h後，棄去培養基，分別使用1. 25、2. 5、5、10、20、40、80nmol/L OA染毒HL-7702肝細胞，同時設甲醇對照和空白對照，各試驗組設6個復孔；A23) OA染毒24h後，PBS洗滌2_3次，對其進行染色，使用TECAN InfiniteMlOOO多功 能酶標儀進行激發波長和發射波長的3D掃描；A24)可信區內選擇最大相對螢光單位值對應的波長即為最佳激發波長和最佳發射波 長，分別為Ex = 511nm, Em = 529nm ；最佳激發波長和最佳發射波長條件下，進行螢光強度 的掃描；A25)以OA濃度為橫坐標，解聚率為縱坐標，建立半對數坐標，建立OA誘導HL-7702肝 細胞F-actin解聚的標準曲線。
7.如權利要求1或者2所述的腹瀉性貝類毒素檢測方法，其特徵是使用甲醇溶劑進 行貝類樣品的提取，所述甲醇的濃度為1_4%。
全文摘要
本發明公開了一種腹瀉性貝類毒素檢測方法，包括步驟A)建立大田軟海綿酸(okadaic acid，OA)誘導HL-7702肝細胞F-肌動蛋白(F-actin)解聚的標準曲線；B)根據HL-7702肝細胞的F-actin解聚的標準曲線進行OA濃度的計算，建立腹瀉性貝類毒素的細胞F-actin檢測方法，確定可能的檢出限範圍；C)選擇與腹瀉性貝類毒素可能共存的成分STX、DA、YTX中的一種或幾種作用HL-7702肝細胞，通過檢測其破壞HL-7702肝細胞F-actin聚合能力的大小確定該方法測定OA含量的特異性。本發明所述的檢測方法，具有優點(1)以細胞為實驗對象，避免了實驗動物的使用，符合3R原則；(2)靈敏度高；(3)特異性較好；(4)重複性好；(5)樣品提取簡便，基質效應低。
文檔編號G01N1/30GK101975768SQ20101026683
公開日2011年2月16日 申請日期2010年8月27日 優先權日2010年8月27日
發明者劉建軍, 莊志雄, 彭朝瓊, 袁建輝, 黃海燕, 黃愛君, 黃薇 申請人:深圳市疾病預防控制中心