一種溶酶體靶向的次氯酸根離子螢光探針及其應用的製作方法

2023-05-30 11:18:46 1

本發明涉及一種快速檢測細胞中溶酶體內次氯酸根離子的螢光探針的製備方法和應用，屬於分析化學技術領域。

背景技術：

近年來，對環境、生物體系內乃至醫藥方面無機陰離子的檢測備受矚目。無機陰離子中活性氧類化合物在生理過程和病理過程起重要作用。其中次氯酸在生命體中主要靠過氧化氫和氯離子在髓過氧化酶(mpo)催化下反應生成。生理條件下，大約一半的次氯酸理解成次氯酸根，次氯酸根也是自然界中最強的氧化劑之一。在生活中次氯酸根也是被廣泛應用的一種強氧化劑。次氯酸和機體的免疫性能有關，能夠殺滅很多種病原體。但是，機體中過量的氧化物的產生也會對其本身造成傷害。已經有證據表明次氯酸跟一些組織的炎症有關，而且人們認為中性粒細胞釋放的次氯酸跟跟肺部受損、類風溼性關節炎、肝缺血再灌注損傷以及腎臟疾病有關。因為次氯酸的重要性，對其檢測特別是生命體中的檢測就顯得十分重要。

螢光檢測方法因為它的高靈敏度和很好的時空解析度，成為一種被廣泛應用於實時檢測並能夠對一些生物體系內重要的物種進行成像檢測的方法。它能夠提供這些物種在細胞、組織甚至活體中的動態信息，比如一些生物分子的分布和分布的量。1,8-萘醯亞胺類化合物是一種重要的螢光團，具有高的光穩定性、大的stokes位移、較強的螢光發射等優點，被廣泛應用於聚合物、儲光物質、dna切割和燃料等方面。

已報導的次氯酸螢光探針存在著諸多缺陷，如靈敏度低，選擇性差，響應速度慢以及合成複雜等，更主要的缺陷是靶向性差，已申請的專利[cn103173213a]、[cn104910070a]展示了特異性選擇次氯酸的螢光探針，但是不具有靶向性，不能用於溶酶體中次氯酸根的檢測，鑑於此，開發定位溶酶體中次氯酸根的檢測成為目前亟待解決的課題。

技術實現要素：

本發明所要解決的問題是：克服現有技術存在問題，提供一種靶向檢測細胞溶酶體中次氯酸根離子的螢光探針。該探針結構新穎，合成簡單，生物兼容性好，對次氯酸根離子選擇性好，靈敏度高，能夠定向檢測細胞溶酶體中的次氯酸根離子。

本發明還提供該螢光探針的製備方法以及該探針檢測次氯酸根離子的應用。

本發明採用如下技術方案：基於1,8-萘醯亞胺，在醯亞胺n原子引入溶酶體定位基，4位br被甲硫醇鈉取代作為次氯酸根識別基團。其特徵在於，其結構如式（ⅰ）所示：

式（ⅰ）

合成路線如下：

上述螢光探針的製備方法，其特徵在於，製備方法包含以下步驟：1)將4-溴-1,8-萘二甲醯亞胺溶於乙醇，加入胺基嗎啡啉，回流。反應完成後室溫下冷卻反應液，濾除固體，柱層析純化，即得n16-1。2)將n16-1和碳酸鉀溶於dmf中，加入甲硫醇鈉，氮氣保護下恆溫反應。反應結束後將反應液冷卻至室溫，倒入水中，有固體產生，濾得固體，出層析純化即得n16。

所述步驟1)中矽膠柱洗脫劑為乙酸乙酯。

所述步驟2)中矽膠柱洗脫劑為二氯甲烷。

本發明還提供了上述螢光探針的應用，其特徵在於，該探針用於純緩衝溶劑體系和生物細胞體系中次氯酸根離子的含量檢測；所屬的含量檢測包括螢光檢測，目視定性檢測，細胞成像檢測。

本發明優點是：(1)探針結構新穎，合成容易且後處理簡單；(2)本發明實現了對次氯酸根離子的快速檢測，並且選擇性好，抗幹擾能力強。肉眼即可觀測到檢測後的溶液顏色變化，紫外燈下也能看到檢測後溶液的螢光顏色變化。(3)本發明可應用於生物體系細胞內溶酶體中次氯酸根的檢測。

附圖說明

圖1:n16對clo-的螢光選擇性實驗。

圖2:n16對clo-的紫外選擇性實驗。

圖3:n16檢測clo-的競爭性試驗。

具體實施方案

實施例1。目標探針化合物n16的製備：1)化合物n16-1的合成：將1g(3.6mmol)4-溴-1,8-萘二甲醯亞胺溶於乙醇，加入1g(7.2mmol)嗎啡啉，回流。反應完成後室溫下冷卻反應液，濾除固體，柱層析純化，即為目標產物n16-1，產率85%；2)化合物n16的合成：將388mg(1mmol)n16-1和276mg(2mmol)碳酸鉀溶於5mldmf中，加入140mg(2mmol)甲硫醇鈉，氮氣保護下恆溫80℃反應2h。反應結束後將反應液冷卻至室溫，倒入40ml水中，有固體產生，濾得固體，出層析純化即得n16，產率88%。

實施例2。n16對clo-的螢光選擇性實驗：取實施例1製備的n16次氯酸根螢光探針溶於dmf中，製成1mmol/l儲備液。取30μl儲備液加到3ml的pb緩衝溶液(ph=7.4)中，然後分別加入30μl濃度為100μm的不同陰離子和陽離子，clo-的加入使螢光完全淬滅。激發波長405nm，發射波長506nm。縱坐標表示螢光強度，橫坐標表示波長；n16對clo-的紫外選擇性實驗：取實施例2中螢光探針儲備液30μl加到3ml的pb緩衝溶液(ph=7.4)中，分別加入30μl濃度為100μm不同陰離子和陽離子後的可見吸收光譜。clo-的加入405nm處的吸光度顯著下降，350nm處的吸光度顯著增強。縱坐標表示吸光度，橫坐標表示波長；n16檢測clo-的競爭性試驗：取實施例2中螢光探針儲備液30μl加到3ml的pb緩衝溶液(ph=7.4)中，先加入濃度為100μm的不同陰離子和陽離子，再加入100μmclo-的螢光強度變化。表明n16檢測clo-不受其他常見共存離子的影響。縱坐標表示螢光強度，橫坐標表示離子種類。