Nad、氫氧化鋁複合佐劑及含該複合佐劑的疫苗的製作方法
2023-06-06 23:56:11 1
專利名稱：Nad、氫氧化鋁複合佐劑及含該複合佐劑的疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種複合佐劑，具體涉及一種煙醯胺腺嘌呤二核苷酸與氫氧化鋁的複合佐劑，屬於免疫學技術領域。
背景技術：
近年來，隨著免疫學研究的不斷深入及基因工程技術的迅速發展，活載體疫苗、 DNA疫苗和蛋白質疫苗等新型疫苗的研究取得了可喜的進步。這些新型疫苗純度高、特異性強，但免疫原性弱，誘導機體免疫應答不夠強，因此應用佐劑來增強其免疫原性或增強宿主對抗原免疫應答就顯得尤為重要。人們在尋找新型佐劑的同時，對常規佐劑的改良研究也更加重視起來。雖已湧現不少新型佐劑，但都處於試驗研究階段。目前在疫苗產業中鋁佐劑是最傳統、最重要也是應用最多的疫苗佐劑。鋁佐劑的作用機理主要是在組織中形成抗原貯藏庫產生顆粒性抗原，促進抗原遞呈給免疫細胞，使抗原滯留，緩慢釋放，從而吸引活性淋巴細胞，激活補體系統。但作為疫苗佐劑，其靶向性存在缺陷，不能引起機體的特異性細胞免疫應反應。而其他一些正在研究中的已證實有佐劑作用的物質，由於安全性、有效性或經濟方面問題，未能被批准用於人體。煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是生物代謝過程中的一種重要輔酶，其結構式如圖所示(圖I)。它的基本生理功能是維持細胞的生長、分化和能量的代謝，不僅對細胞內的氧化還原狀態具有重要的調節作用，而且常被作為活體內的代謝指標，與細胞的代謝、節律、 衰老、病變、死亡等重大生命過程有著極其緊密的聯繫。Friedrich Haag證實NAD是一種細胞內源性危險信號。同時其可作為T細胞的免疫調節分子，誘導鼠類CD4+及CD8+T細胞的凋亡，但其是否具有佐劑作用尚不明確。
發明內容
為解決現有疫苗佐劑存在毒副作用、價格昂貴等問題，本發明提供一種安全、有效、穩定、便宜的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸與氫氧化鋁的複合佐劑。本發明還提供一種含有煙醯胺腺嘌呤二核苷酸與氫氧化鋁的複合佐劑的疫苗。本發明提供的是這樣一種NAD、氫氧化鋁複合佐劑，其特徵在於由下列質量比的組分組成煙醯胺腺嘌呤二核苷酸氫氧化鋁=I 5 50 100。所述煙醯胺腺嘌呤二核苷酸為市購醫用產品，分子式為C21H26N7O14P2,分子量為 663. 4177，結構式如圖I所示，在人體中的推薦劑量為10 50 μ g。所述氫氧化鋁為目前常用的氫氧化鋁膠體佐劑，其製法參照《中國藥典(三部)》， (國家藥典委員會.北京人民衛生出版社.2005:118-119)，在人體中的劑量為I. 8 2. 7mg 本發明提供的是這樣一種含有複合佐劑的疫苗，其特徵在於在每100 μ L抗原液中加入O. 51 I. 05mg的複合佐劑，且複合佐劑由下列質量比的組分組成煙醯胺腺嘌呤二核苷酸氫氧化鋁=I 5 50 100。所述抗原液是在每100 μ L生理鹽水中，混溶有2Pg抗原。所述抗原為常規B肝表面抗原。煙醯胺腺嘌呤二核苷酸與氫氧化鋁的複合佐劑誘導的免疫反應為體液免疫反應。本發明與現有技術相比具有下列優點和效果(I)本複合佐劑無毒、副作用，不積累毒性，在免疫劑量範圍內使用是安全可靠的；(2)本複合佐劑能夠有效的誘導抗原特異性的體液免疫應答，且其所誘導的體液免疫應答效果優於單一的鋁佐劑及單一的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸；(3)本複合佐劑原料易得，均為市售產品，製備工藝簡單，成本低，性能穩定，可作為B肝疫苗、蛋白疫苗及病毒疫苗等佐劑；(4)本複合佐劑與疫苗聯合應用能有效增強疫苗體液免疫應答，增強效果優於單一的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸佐劑和單一的氫氧化鋁佐劑。
圖I為煙醯胺腺嘌呤二核苷酸分子結構式；
圖2為使用實施例I提供的複合佐劑後，14周內，各實驗組小鼠血清抗-HBsIgG抗體水
平；
圖3為使用實施例2提供的複合佐劑後，14周內，各實驗組小鼠血清抗-HBsIgG抗體水
平；
圖4為使用實施例3提供的複合佐劑後，14周內，各實驗組小鼠血清抗-HBsIgG抗體水
平；
圖5為使用實施例4提供的複合佐劑後，14周內，各實驗組小鼠血清抗-HBsIgG抗體水平。
具體實施例方式下面結合實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。文中所述的較佳條件實施方法僅作示範之用。實施例I
本發明提供的複合佐劑由下列質量比的組分組成煙醯胺腺嘌呤二核苷酸氫氧化鋁 =I 100。本發明提供的含有複合佐劑的疫苗是在每100 μ L抗原液中，加入I. Olmg的複合佐劑混合而成的，其中，複合佐劑由下列質量比的組分組成煙醯胺腺嘌呤二核苷酸氫氧化鋁=I 100，抗原液是在每100 μ L生理鹽水中，混溶有2Pg抗原，該抗原為常規B肝表面抗原，購自深圳康泰生物製品有限公司，煙醯胺腺嘌呤二核苷酸NAD購自上海基米生物科技有限公司，氫氧化鋁為常用的氫氧化鋁膠體佐劑，其製法參照《中國藥典(三部)》，(國家藥典委員會·北京人民衛生出版社.2005:118-119)。本實施例I所得B肝表面抗原的免疫試驗和效果如下
A、免疫
將ICR小鼠分為複合佐劑組、氫氧化鋁單一佐劑組、無佐劑組和空白組，共五組，每組25隻。注射實施例I的含有複合佐劑的疫苗總體積為100μ L，經腿部肌肉注射到小鼠體內。氫氧化鋁單一佐劑組是將氫氧化鋁Img和B肝表面抗原2Pg混溶於100 μ L生理鹽水中，再經腿部肌肉注射到小鼠體內。無佐劑組是將B肝表面抗原2Pg溶於100 μ L生理鹽水中，再經腿部肌肉注射到小鼠體內。空白組是對每隻小鼠注射100 μ L生理鹽水。免疫方案在第O周經腿部肌肉免疫小鼠，免疫次數為一次。B、ELISA檢測血清抗一 HBsIgG水平
在第O周免疫後第4、6、8、10、12、14周，採集小鼠尾靜脈血，分離血清，ELISA檢測血清抗一 HBs IgG水平，按蛋白微孔試劑盒方法進行檢測，具體方法是40μ1 HBsAg溶於IOml IX包被稀釋液，混勻，包被96孔酶標板，ΙΟΟμΙ/孔；酶標板放於溼盒，4°C下過夜；倒掉孔內液體，拍淨板子；加入1ΧΒ8Α,200μ1/孔，酶標板在37°C溼盒放置Ih ;倒掉孔內液體，拍淨板子；血清經倍比稀釋後，加入酶標板，ΙΟΟμΙ/孔，37°C溼盒放置Ih ;用試劑盒配製的洗液洗板4次，每次5min，末次拍淨酶標板；加入試劑盒配製的二抗，ΙΟΟμΙ/孔，37°C溼盒放置 Ih ;用洗液洗板4次，每次5min，末次拍淨酶標板；加入試劑盒配製的顯色液，ΙΟΟμΙ/孔，避光顯色10 25min ;加終止液,每孔ΙΟΟμΙ ;酶標板放入酶標儀,在405nm處讀板。C、數據分析
對所獲得的實驗數據以SPSS11. 5統計軟體進行單因素方差分析，以P < 0. 05為差異的統計學意義。表I為使用實施例I提供的複合佐劑後，14周內，各實驗組小鼠血清抗-HBsIgG抗體水平(0D值)。表I
權利要求
1.一種NAD、氫氧化鋁複合佐劑，其特徵在於由下列質量比的組分組成煙醯胺腺嘌呤二核苷酸氫氧化鋁=I 5 50 100。
2.根據權利要求I所述的NAD、氫氧化鋁複合佐劑，其特徵在於所述氫氧化鋁為常規氫氧化招佐劑。
3.根據權利要求I所述的NAD、氫氧化鋁複合佐劑，其特徵在於所述煙醯胺腺嘌呤二核苷酸為市購醫用產品，分子式為C21H26N7O14P2，分子量為663. 4177。
4.一種含有複合佐劑的疫苗，其特徵在於在每100 μ L抗原液中加入O. 51 1.05mg 的複合佐劑，且所述複合佐劑由下列質量比的組分組成煙醯胺腺嘌呤二核苷酸氫氧化鋁=I 5 50 100。
5.根據權利要求4所述的含有複合佐劑的疫苗，其特徵在於所述抗原液是在每100μ L 生理鹽水中，混溶有2Pg抗原。
6.根據權利要求5所述的含有複合佐劑的疫苗，其特徵在於所述抗原為常規B肝表面抗原。
全文摘要
本發明提供一種NAD、氫氧化鋁複合佐劑及含該複合佐劑的疫苗，複合佐劑由下列質量比的組分組成煙醯胺腺嘌呤二核苷酸︰氫氧化鋁＝1～5︰50～100。所述含有複合佐劑的疫苗，是在每100μL抗原液中加入0.51～1.05mg的複合佐劑。本發明提供的複合佐劑原料易得、製備工藝簡單、成本較低、較為穩定、可以作為B型肝炎疫苗、蛋白疫苗、病毒疫苗等佐劑。該複合佐劑與疫苗聯合應用能有效增強疫苗體液免疫應答，增強效果優於煙醯胺腺嘌呤二核苷酸單一佐劑和氫氧化鋁佐劑，而且無毒、副作用，在免疫劑量範圍內使用是安全可靠的。
文檔編號A61K39/39GK102580081SQ20121004089
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月22日 優先權日2012年2月22日
發明者王海漩, 王琳, 胡云章, 胡凝珠 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所