系統誘導黃瓜抗白粉病生物型種衣劑的製備方法
2023-06-07 01:27:11
專利名稱：系統誘導黃瓜抗白粉病生物型種衣劑的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種系統誘導黃瓜抗白粉病生物型種衣劑的製備方法，採用拮抗木黴菌T23(Trichoderma atroviride)經限制性內切酶介導整合後所得的突變株F3發酵產生的代謝物與一種內生型拮抗枯草芽孢桿菌B20-006(Bacillussubtilis)復配成一種新型生物型種衣劑，在明顯促進黃瓜幼苗的生長同時還能夠提高對黃瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)的系統抗性。
背景技術：
木黴菌作為世界目前應用最為廣泛的生物防治菌，其防治病害機理除具有對病原菌重寄生、抗生作用外，還具有明顯誘導宿主植物潛在抗性相關基因表達的功能。目前已證明木黴菌或枯草芽孢桿菌可誘導黃瓜、棉花、菸草、萵苣和辣椒等作物產生對多種病害如灰黴病(Botrytis cinerea)、炭疽病(Colletotrichum lindemuthianum，C.orbicular，C.graminiicolar)、疫黴病(Phytophthora capsci)、早疫病(Alternaria solani)、細菌病害(Pseudomonassyringae pv.lachrymans，Xanthomonas campestris pv.phaseoli，X.oryzae)和病毒病(Cucumber Green-mottle)的抗性作用，但迄今為止尚沒有報導利用木黴菌代謝物和枯草芽孢桿菌複合作用處理黃瓜種子，進而通過信號轉導誘導黃瓜地上部葉片產生對白粉病的抗性。以往很多研究儘管證明了木黴菌或枯草芽孢桿菌活體條件下可明顯誘導宿主植物潛在抗性相關基因表達，但在實際應用中遇到一些困難(1)以單一活體木黴菌或枯草芽孢桿菌為主的誘抗劑儘管可不斷在種圍和根圍繁殖，產生誘導抗性代謝物，但在實際應用中活體微生物種群和活性很易受到土壤內各種環境因素的影響，導致誘導抗性效果不穩定。(2)以微生物代謝產物為生物型種劑主要成分，雖然容易實現誘抗劑使用的定量化，但同樣會因土壤內其它微生物的吸附與分解作用，使誘導抗性的有效劑量很難保證，很難實現宿主抗性的持續誘導。因此如何發揮活體微生物和其代謝產物在誘導抗性中各自的優點，研製高效、穩定的生物型種衣劑具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種系統誘導黃瓜抗白粉病生物型種衣劑的製備方法，製得的生物型種衣劑具有壽命長、防效高、耐儲存等優點，對黃瓜白粉病有很好的防治效果。
為實現這樣的目的，本發明採用拮抗木黴菌T23的突變株F3經過液體發酵產生的代謝物與一種內生型拮抗枯草芽孢桿菌B20-006，復配成一種新型生物型種衣劑。首先分別製備內生枯草芽孢桿菌懸浮液和木黴菌突變株發酵液，然後將十二烷基苯磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉、羅丹明、水楊酸等助劑和無機離子加入到蒸餾水中，攪拌均勻配成助劑溶液，再將枯草芽孢桿菌懸浮液及木黴菌突變株發酵液依次加入到助劑溶液中並調節其中活性組分的濃度，得到所需的系統誘導黃瓜抗白粉病生物型種衣劑。這種含有誘導抗性功能的木黴菌突變株代謝物和活體內生枯草芽孢桿菌的種衣劑，能克服木黴菌分生孢子存活期短以及枯草芽孢桿菌單一誘導效果不穩定的缺點。
本發明的種衣劑主要組分為生物組分內生型拮抗枯草芽孢桿菌B20-006；非生物組分拮抗木黴菌突變株F3的發酵液；助劑1十二烷基苯磺酸鈉0.5％-2.5％；助劑2羧甲基纖維素鈉1％-3％；助劑3羅丹明0.5％-1.5％；水楊酸0.005％-0.015％；無機離子包括K2HPO30.5％-1.5％、MgSO40.05％-0.15％、CaCO30.05％-0.15％、ZnSO40.005％-0.015％及四硼酸鉀0.005％-0.015％。
本發明的種衣劑製備方法包括如下具體步驟1、內生枯草芽孢桿菌懸浮液的製備將拮抗內生枯草芽孢桿菌B20-006接種於LB液體培養基中，25℃135轉/分振蕩培養4天，5000轉/分離心5分鐘，棄上清液，用無菌水洗滌沉澱，5000轉/分下離心5分鐘，棄上清液，洗滌3次後用少量無菌蒸餾水懸浮菌體，製得內生枯草芽孢桿菌懸浮液備用。
2、木黴菌突變株發酵液的製備將拮抗木黴菌突變株F3接種於PDA固體培養基上，25℃下培養6天，使菌落表面產生大量分生孢子，用無菌蒸餾水將孢子洗下，並配成濃度為3×107個孢子/毫升的孢子懸浮液，在PDB液體培養基內培養，接菌量為每100毫升培養基接種5毫升孢子懸浮液，在141轉/分、28℃的條件下發酵3天，然後過濾去除菌絲，得到木黴菌突變株發酵液。
3、助劑溶液的配製以重量百分比計，將0.5％-2.5％的十二烷基苯磺酸鈉、1％-3％的羧甲基纖維素鈉、0.5％-1.5％的羅丹明、0.005％-0.015％的水楊酸、0.5％-1.5％的K2HPO3、0.05％-0.15％的MgSO4、0.05％-0.15％的CaCO3、0.005％-0.015％的ZnSO4、0.005％-0.015％的四硼酸鉀，依次加入到蒸餾水中，攪拌成均勻的黏稠狀液體，配成助劑溶液。
4、將內生枯草芽孢桿菌懸浮液及80-120毫升的木黴菌突變株發酵液依次加入到助劑溶液中，振蕩混合均勻，調節拮抗枯草芽孢桿菌終濃度為1010菌落形成單位cfu/毫升，得到系統誘導黃瓜抗白粉病生物型種衣劑。
將本發明所得的種衣劑對黃瓜種子進行包衣處理，待幼苗長至兩片真葉的時候進行白粉菌(Sphaerotheca fuliginea(Schlecht)Poll.)的挑戰接種，6天後調查病情指數，結果發現本發明的生物型種衣劑在明顯促進黃瓜幼苗的生長同時還能夠提高黃瓜對白粉病的系統抗性，對白粉病相對防治效果達70-75％。
本發明的種衣劑含有誘導抗性功能的木黴菌突變株代謝物和活體內生枯草芽孢桿菌，能克服種衣劑中木黴菌分生孢子存活期短以及枯草芽孢桿菌單一誘導效果不穩定的缺點，具有壽命長、防效高、耐儲存等優點，對黃瓜白粉病有很好的防治效果。本發明適用於大多數瓜類品種，製備方法簡單易行，適合於大規模工廠化生產，市場前景廣闊。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例對本發明的技術方案作進一步描述。
實施例11、內生枯草芽孢桿菌懸浮液的製備將拮抗枯草芽孢桿菌B20-006接種於LB液體培養基中，培養基組分為胰化蛋白腖10克、氯化鈉10克、酵母提取物5克、水1000毫升、pH7.0。25℃135轉/分振蕩培養4天，5000轉/分離心5分鐘，棄上清液，用無菌水洗滌沉澱，再5000轉/分下離心5分鐘，棄上清液，洗滌3次後用少量無菌蒸餾水懸浮菌體，製得內生枯草芽孢桿菌懸浮液備用。
2、木黴菌突變株發酵液的製備將拮抗木黴菌突變株F3接種於PDA固體培養基上，培養基組分為馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂15-20克、水1000毫升。25℃下培養6天後，菌落表面產生大量分生孢子，用無菌蒸餾水將分生孢子洗下，並配成濃度為3×107個孢子/毫升的孢子懸浮液，液體發酵培養基採用PDB液體培養基，培養基組分為馬鈴薯200克、葡萄糖20克、酵母提取物15克。接菌量為每100毫升培養基接種5毫升孢子懸浮液，在141轉/分、28℃的條件下，發酵3天，然後過濾去除菌絲，得到木黴菌突變株發酵液。
3、助劑溶液的配製取十二烷基苯磺酸鈉7.5克、羧甲基纖維素鈉10克、羅丹明5克、水楊酸0.05克以及無機離子K2HPO35克、MgSO40.5克、CaCO30.5克、ZnSO40.05克、四硼酸鉀0.05克；將上述各組分依次加入到300毫升蒸餾水中，攪拌成均勻的黏稠狀液體，配成助劑溶液。
4、將拮抗芽孢桿菌B20-006懸浮液及80毫升拮抗木黴菌突變株發酵液依次加入到研磨好的上述黏稠液中，振蕩混合均勻，調節拮抗枯草芽孢桿菌終濃度為1010菌落形成單位cfu/毫升，加蒸餾水補足500毫升，得到系統誘導黃瓜抗白粉病生物型種衣劑。
生物型種衣劑誘導抗性效果的檢測在育苗前期，將黃瓜種子在55℃水浴中溫湯浸種12-15分鐘，取出晾乾，然後用種衣劑包衣種子。按照每毫升種衣劑浸50-55粒種子的比例浸潤30分鐘左右，待種衣劑完全附著於種子上時即可取出，充分晾乾，經種衣劑處理後的種子可在28℃溫箱中催芽24小時左右，催芽時要保證一定的溼度，亦可不經催芽直接播種。
將經過生物型種衣劑處理的黃瓜種子播種在盛有滅過菌且體積配比為3∶2∶1的草炭土，蛭石，草木灰的塑料缽內，每缽2株，再置於溫度，光照，溼度良好的溫室內培養12-14天，待黃瓜兩片子葉充分展平後進行白粉病的挑戰接種，6天後調查病情指數，結果表明該種衣劑在明顯促進黃瓜幼苗生長的同時亦能提高黃瓜幼苗對白粉病的系統抗性，對白粉病相對防治效果在70％以上。
實施例21、內生枯草芽孢桿菌懸浮液的製備將拮抗枯草芽孢桿菌B20-006接種於改進的LB液體培養基中，25℃135轉/分振蕩培養4天，5000轉/分離心5分鐘，棄上清液，用無菌水洗滌沉澱，再5000轉/分下離心5分鐘，棄上清液，洗滌3次後用少量無菌蒸餾水懸浮菌體，製得內生枯草芽孢桿菌懸浮液備用。
2、木黴菌突變株發酵液的製備將拮抗木黴菌突變株F3接種於改良的PDA固體培養基上，25℃下培養6天後，菌落表面產生大量分生孢子，用無菌蒸餾水將分生孢子洗下，並配成濃度為3×107個孢子/毫升的孢子懸浮液，液體發酵培養基採用PDB液體培養基，接菌量為每100毫升培養基接種5毫升孢子懸浮液，在141轉/分、28℃的條件下，發酵3天，然後過濾去除菌絲，得到木黴菌突變株發酵液。
3、助劑溶液的配製取十二烷基苯磺酸鈉8.5克、羧甲基纖維素鈉9克、羅丹明5克、水楊酸0.06克以及無機離子K2HPO34克、MgSO40.6克、CaCO30.4克、ZnSO40.06克、四硼酸鉀0.04克；將上述各組分依次加入到300毫升蒸餾水中，攪拌成均勻的黏稠狀液體，配成助劑溶液。
4、將拮抗芽孢桿菌B20-006懸浮液及120毫升的拮抗木黴菌突變株發酵液依次加入到研磨好的上述黏稠液中，振蕩混合均勻，調節拮抗枯草芽孢桿菌終濃度為1010菌落形成單位/毫升，加蒸餾水補足500毫升，得到系統誘導黃瓜抗白粉病生物型種衣劑。
將經過生物型種衣劑處理中感病品種黃瓜，種子播種在盛有滅過菌且體積配比為3∶2∶1的草炭土，蛭石，草木灰的塑料缽內，每缽2株，再置於溫度，光照，溼度適合的溫室內育苗12-14天，待黃瓜兩片子葉充分展平後，移栽到溫室土壤，以未進行種衣劑處理的為對照，正常的田間溼度等管理條件下，待對照區黃瓜白粉病病葉率達到40％，病情指數達到25％，調查處理區的防效，結果表明該種衣劑在溫室田間能誘導黃瓜對白粉病的系統抗性，對白粉病相對防治效果在65％以上。
權利要求
1.一種系統誘導黃瓜抗白粉病生物型種衣劑的製備方法，其特徵在於包括如下具體步驟1)將拮抗內生枯草芽孢桿菌B20-006接種於LB液體培養基中，25℃135轉/分鐘振蕩培養4天，5000轉/分離心5分鐘，棄上清液，用無菌水洗滌沉澱，5000轉/分下離心5分鐘，棄上清液，洗滌後用無菌蒸餾水懸浮菌體，製得內生枯草芽孢桿菌懸浮液備用；2)將拮抗木黴菌突變株F3接種於PDA固體培養基上，25℃下培養6天，使菌落表面產生大量分生孢子，用無菌蒸餾水將孢子洗下，並配成濃度為3×107個孢子/毫升的孢子懸浮液，在PDB液體培養基內培養，接菌量為每100毫升培養基接種5毫升孢子懸浮液，在141轉/分、28℃的條件下發酵3天，然後過濾去除菌絲，得到木黴菌突變株發酵液；3)以重量百分比計，將0.5％-2.5％的十二烷基苯磺酸鈉、1％-3％的羧甲基纖維素鈉、0.5％-1.5％的羅丹明、0.005％-0.015％的水楊酸、0.5％-1.5％的K2HPO3、0.05％-0.15％的MgSO4、0.05％-0.15％的CaCO3、0.005％-0.015％的ZnSO4、0.005％-0.015％的四硼酸鉀，依次加入到蒸餾水中，攪拌成均勻的黏稠狀液體，配成助劑溶液；4)將內生枯草芽孢桿菌懸浮液及80-120毫升的木黴菌突變株發酵液依次加入到助劑溶液中，振蕩混合均勻，調節拮抗枯草芽孢桿菌終濃度為1010菌落形成單位cfu/毫升，得到系統誘導黃瓜抗白粉病生物型種衣劑。
全文摘要
本發明涉及一種統誘導黃瓜抗白粉病生物型種衣劑的製備方法，採用拮抗木黴菌突變株發酵產生的代謝物與一種內生型拮抗枯草芽孢桿菌，復配成新型生物型種衣劑。首先分別製備內生枯草芽孢桿菌懸浮液和木黴菌突變株發酵液，然後將十二烷基苯磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉、羅丹明、水楊酸等助劑和無機離子與蒸餾水攪拌均勻配成助劑溶液，再將枯草芽孢桿菌懸浮液及木黴菌突變株發酵液依次加入到助劑溶液中並調節其中活性組分的濃度，得到所需的系統誘導黃瓜抗白粉病生物型種衣劑。這種含有誘導抗性功能的木黴菌突變株代謝物和活體內生枯草芽孢桿菌的種衣劑，具有壽命長、防效高、耐儲存等優點，對黃瓜白粉病有很好的防治效果。
文檔編號A01C1/06GK1911043SQ20061002988
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月10日 優先權日2006年8月10日
發明者陳捷, 屈中華, 高增貴, 徐書法 申請人:上海交通大學