篩選含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重組痘苗病毒的方法
2023-06-06 21:00:11
專利名稱：篩選含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重組痘苗病毒的方法
技術領域：
本發明屬於基因工程疫苗生物技術領域，涉及篩選含有外源融合基因 HIV/gag/IFNa-2b的重組痘苗病毒的方法。
背景技術：
愛滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS )是本世糹已以來對 人類威脅最嚴重的傳染病。愛滋病病毒對人體免疫功能的破壞所產生的難 以治癒的感染和腫瘤已經威脅了人類社會的生存和發展。特別是愛滋病在 傳播蔓延過程中一個最引人關注的現象是，全球愛滋病病毒新感染者中， 青少年佔一半以上。目前，尚未有能從根本上徹底治療和預防愛滋病的有 效藥物。現行的各種治療措施都是嘗試性的。由於愛滋病主要是和免疫系 統有關的疾病，因而獲得可靠的免疫預防保護是從根本上解決愛滋病流行 傳播的關鍵。人獲得性免疫缺陷病毒(HIV)作為反轉錄RNA慢病毒，是 傳播AIDS的主要病原體。核心蛋白(gag)是HIV的主要結構蛋白之一。 gag蛋白能夠誘導動物產生包括中和抗體的體液免疫和細胞免疫，並能夠自 我裝配形成病毒樣粒子(Vims-like particle，VLP )。表面具有活化B細胞的 一級結構表位和誘發細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應，胺基酸序列相對 保守，是新型疫苗設計的理想區域。有關HIV疫苗的研製多數是圍繞著外 膜蛋白(eiw)展開的，而本項發明利用HIV核心蛋白(gag)基因片段， 構建在真核細胞表達的融合基因。表達的蛋白產物即可作為抗原進行免疫 預防，又可作為診斷試劑篩查感染人群。
發明內容
本發明的目的是提供一種分子生物學領域的操作技術，通過構建一個 基因重組表達質粒，篩選出一株含有外源融合基因HIV/gag/IFNa-2b的重組 痘苗病毒。
本發明是通過如下技術方案實現的
將編碼人幹擾素a-2b的基因序列與編碼人HIV-lgag基因融合，構建讀 框吻合的外源融合基因片斷，並克隆到痘苗病毒表達載體pJ38中，構建了 含有HIV-lgag和IFNa-2b外源融合基因的重組表達質粒pJ38gag/IFNa-2b， 在真核細胞中忠實地翻譯了原有的基因序列，連續穩定地表達了 gag/IFNa-2b融合蛋白，pJ38gag/IFNa-2b基因表達產物在體外能與 HIV-lgag陽性血清發生特異性反應，具備免疫原性和免疫反應性，無返祖 現象。為研究愛滋病病毒結構蛋白的的抗原性，提供了一個獲得愛滋病病 毒核心蛋白的途徑。為研究愛滋病感染者的檢測診斷試劑與免疫預防治療 提供重要的理論依據。 本發明的技術解決方案包括以下步驟 1. pJ38gag/IFNa-2b基因重組與鑑定
在無菌條件下製備大腸桿菌感受態細胞，置-7(TC超低溫冰箱凍存，用 於轉化質粒。採用CaCl2轉化的方法，將含有目的基因的載體質粒轉入五."//HBIOI、 JM109、 DH-5a、 JM101甲，在賞50昭/ml Amp的LB液體培界丞 中37"C振搖培養24h，分別以質粒小量提取、質粒大量提取方法製備含有 目的基因的載體和表達載體，以5V/cm的電壓在瓊脂糖凝膠上電泳以及用 限制性內切酶的酶切反應鑑定目的基因和載體，當溴酚藍電泳至適當位置 後，用長波紫外燈觀察並記錄結果或拍照保存，採用分光光度計測定法檢 測260nm和280nm的光密度OD值，計算提取質粒的濃度，置-20。C冰箱中 保存，備用於連接反應。DNA目的基因片斷與載體的回收根據實驗目的和 DNA分子量大小分別釆用凍融法、DEAE-81纖維素膜電泳回收法、低熔點 瓊脂糖凝膠回收法與透析袋法。酶切DNA片段的3'凹端補平與線性質粒 DNA的5'端去磷分別釆用dNTP、Klenow大片段與牛小腸鹼性磷酸酶(CIP ) 分別置室溫、37°C、 55°C、 75。C反應，將3'凹端補平與5'端去磷的線性質 粒DNA用適量T4DNA連接酶(0.5weiss單位)置16。C水洛過夜或25°C lh。 進行連接反應。重組子的篩選和鑑定釆用酶切法。挑選酶切結果與理論預 計值相同者進一步用兩種以上內切酶消化，所有酶切結果均與預計完全相 同者，即為目的重組質粒。結果構建了內含目的基因片段 gag/IFNa-2b(nt531-ntl507+nt336-ntll71+ntl507-nt1712)， 分子量約為 8.351kb的重組表達質粒pJ38gag/IFNa-2b。 2. pJ38gag/IFNa-2b在真核細胞中表達與鑑定
真核細胞表達是以野生型痘苗病毒為介導轉基因，釆用脂質體轉染細 胞法，使pJ38gag/IFNa-2b在細胞內與野生型痘苗病毒發生同源重組具體 操作是分別在35mm平皿中培養的RK、BHK21以及Cos-7細胞中感染野生 型痘苗病毒，感染MOI(Multiplicity of infection)為0.1的野生型病毒，於 37°C、 5%(202反應lh後與包裹脂質體的質粒進行共轉染，同時設未感染病 毒的正常細胞和未加轉染試劑的痘苗病毒感染細胞為對照。培養48h後， 以血凝素基因(HA)為報告基因，篩選純化含目的基因pJ38gag/IFNa-2b的重 組痘苗病毒。本實驗經加入預先處理好的雞紅細胞後鏡下觀察，由於野生 型病毒具有完整的HA基因，所以非重組病毒感染的細胞有HA基因蛋白表 達的血凝素而能吸附雞紅細胞。肉眼觀察可見病毒蝕斑呈紅色片狀，光鏡 下可見大量雞紅細胞被吸附在病變細胞的表面。重組病毒由於外源基因片 段的插入使HA失活，其感染的細胞不能表達血凝素，故喪失了吸附雞紅細 胞的能力。肉眼觀察與非重組病毒蝕斑有明顯差異，鏡下觀察無雞紅細胞 吸附，蝕斑內的細胞多數崩解、脫落，僅剩下少量細胞融合、擁擠成堆、 斑內形成空洞。結果利用HA特性，篩選純化出vJ38gag/IFNa-2b重組痘苗 病毒株，經過3 4代的純化直至穩定表達HA-斑為止，48h後收毒。以細胞 培養法擴增重組痘苗病毒，以間接免疫螢光分析(IFA)、 Dot-ELISA、 SDS 聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)與蛋白印跡(Western blotting)方法鑑 定pJ38gag/IFNa-2b目的基因在真核細胞中的表達產物，確定其分子量。結 果vJ38gag/IFNct-2b重組痘苗病毒株表達的Gag蛋白能被HIV-1血清所識 別，分別能與l: 10倍稀釋後的HIV-lgag陽性血清發生較強的特異性呈色 反應，其分子量為60kDa，與預計理論上的計算值相符合。3. pJ38gag/IFNa-2b錄達產物的兕提原性和兕叛反應性研究
將篩選純化的vJ38gag/IFNa-2b重組痘苗病毒接種於體外培養的單層細 胞，培養約30h左右，收取感染細胞，測定病毒PFU值，調整病毒的滴度 使其達到108PFU,用弗氏佐劑製備樣品，釆用足墊和腹腔兩種免疫途徑免 疫小鼠，加強免疫3次，飼養60天後，眼球取血，無菌製備脾淋巴細胞， 釆用HIV-1間接ELISA試劑盒檢測免疫小鼠血清HIV抗體，在DG5030型 酶聯免疫檢測儀上依次讀取490nm下的光密度值(OD49Q )。流式細胞儀 FACS檢測3000個細胞，所得數據進行統計學分析。結果表明含有 pJ38gag/IFNa-2b基因的重組痘苗病毒株能表達目的蛋白。重組痘苗病毒表 達產物免疫小鼠後，體液免疫檢測結果表明，重組痘苗病毒表達產物免疫 小鼠後可以激發小鼠體內產生高滴度的抗體水平，含IFNa-2b結構基因組與 不含IFNa-2b結構基因組之間比較，前者提高了重組顆粒化抗原的免疫原 性。流式細胞儀檢測3000個T淋巴細胞中標記的陽性細胞表明小鼠體內產 生了細胞免疫。統計學分析，多組間比較作方差分析，組間比較用t檢驗。 t=x-^sx。重組病毒基因表達產物的生物活性研究釆用淋巴細胞轉化實驗與 CTL殺傷活性實驗，結果表明，gag/IFNa-2b融合基因在痘苗病毒中共表達 產物能提高實驗小鼠的體液免疫與細胞免疫，具備免疫原性與免疫反應性。 本發明的實用意義愛滋病病毒對機體免疫系統的CD + 4 T淋巴細胞 具有強烈的嗜性， 一旦人體感染了愛滋病病毒，就會破壞機體內的CD"T 細胞，使CD"細胞數急劇下降，隨之抗HIV中和抗體滴度和CTL數逐漸 下降，致使機體免疫力下降，病人出現嚴重的免疫缺陷綜合症，導致各種 機會性感染和腫瘤，直至患者死亡。但HIV究竟以什麼方式破壞人體的免 疫系統仍是一個沒有解決的問題。因此，尋找使用愛滋病病毒中的哪種結 構蛋白才能作為有效保護性抗原是保護CD"細胞不受侵犯，抑制HIV在體 內擴散，達到從根本上有效治療愛滋病的目的。另'一方面，愛滋病病毒的 最大特點是持續存在著潛伏複製轉換和抗原性漂移，HIV作為RNA逆轉錄 病毒，它在自身複製過程中需要先由病毒基因組RNA反向轉錄為前病毒 DNA，再由前病毒DNA轉錄為病毒基因組RNA。逆轉錄病毒基因組由RNA 向DNA反向轉錄，再由DNA向RNA正向轉錄的過程均是由病毒本身的 RNA酶所催化。這種逆轉錄酶缺少核酸外切酶的活性，轉錄忠實性差，在 催化RNA反向轉錄過程中發生鹼基錯配，逆轉錄酶的無校正功能是HIV產 生變異的重要因素，也給HIV的藥物治療和免疫預防帶來巨大的障礙。我 們的研究正是圍繞上述兩方面的問題展開的，為研究愛滋病感染者的檢測 診斷試劑與基因免疫預防治療提供了一個獲得愛滋病病毒核心蛋白的途徑 和重要的理論實驗依據。
圖1為重組表達質粒pJ38gag/IFN a-2b的構建
圖2為重組質粒酶切鑑定
具體實施例方式
實施例1:重組表達質粒pJ38gag/IFN a-2b的構建(見附圖1) 實施例2:
重組質粒酶切鑑定(見附圖2)
權利要求
1. 篩選含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重組痘苗病毒的方法，其特徵在於包括以下步驟①pJ38gag/IFNα-2b基因重組與鑑定在無菌條件下製備大腸桿菌感受態細胞，置-70℃超低溫冰箱凍存，用於轉化質粒，採用CaCl2轉化的方法，將含有目的基因的載體質粒轉入E.coliHB101、JM109、DH-5α、JM101中，在含50μg/ml Amp的LB液體培養基中37℃振搖培養24h，分別以質粒小量提取、質粒大量提取方法製備含有目的基因的載體和表達載體，以5V/cm的電壓在瓊脂糖凝膠上電泳以及用限制性內切酶的酶切反應鑑定目的基因和載體，當溴酚藍電泳至適當位置後，用長波紫外燈觀察並記錄結果或拍照保存，採用分光光度計測定法檢測260nm和280nm的光密度OD值，計算提取質粒的濃度，置-20℃冰箱中保存，備用於連接反應，DNA目的基因片斷與載體的回收；分別採用凍融法、DEAE-81纖維素膜電泳回收法、低熔點瓊脂糖凝膠回收法與透析袋法；酶切DNA片段的3』凹端補平與線性質粒DNA的5′端去磷分別採用dNTP、Klenow大片段與牛小腸鹼性磷酸酶分別置室溫、37℃、55℃、75℃反應，將3』凹端補平與5′端去磷的線性質粒DNA用0.5weiss單位的T4 DNA連接酶置16℃水浴過夜或25℃ 1h；進行連接反應；重組子的篩選和鑑定採用酶切法；挑選酶切結果與理論預計值相同者進一步用兩種以上內切酶消化，所有酶切結果均與預計完全相同者， 即為目的重組表達質粒pJ38gag/IFNα-2b；②pJ38gag/IFNα-2b在真核細胞中表達與鑑定真核細胞表達是以野生型痘苗病毒為介導轉基因，採用脂質體轉染細胞法，使pJ38gag/IFNα-2b在細胞內與野生型痘苗病毒發生同源重組具體操作是分別在35mm平皿中培養的RK、BHK21以及Cos-7細胞中感染野生型痘苗病毒，感染MOI為0.1的野生型病毒，於37℃、5％CO2反應1h後與包裹脂質體的質粒進行共轉染，同時設未感染病毒的正常細胞和未加轉染試劑的痘苗病毒感染細胞為對照；培養48h後，以血凝素基因為報告基因，篩選純化含目的基因pJ38gag/IFNα-2b的重組痘苗病毒；利用HA特性，篩選純化出vJ38gag/IFNα-2b重組痘苗病毒株，經過3～4代的純化直至穩定表達HA-斑為止，48h後收毒；以細胞培養法擴增重組痘苗病毒，以間接免疫螢光分析、Dot-ELISA、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳與蛋白印跡方法鑑定pJ38gag/IFNα-2b目的基因在真核細胞中的表達產物，確定其分子量；③pJ38gag/IFNα-2b表達產物的免疫原性和免疫反應性將篩選純化的vJ38gag/IFNα-2b重組痘苗病毒接種於體外培養的單層細胞，培養約30h左右，收取感染細胞，測定病毒PFU值，調整病毒的滴度使其達到108PFU，用弗氏佐劑製備樣品，採用足墊和腹腔兩種免疫途徑免疫小鼠，加強免疫3次，飼養60天後，眼球取血，無菌製備脾淋巴細胞，採用HIV-1間接ELISA試劑盒檢測免疫小鼠血清HIV抗體，在DG5030型酶聯免疫檢測儀上依次讀取490nm下的光密度值(OD490)，流式細胞儀FACS檢測3000個細胞，所得數據進行統計學分析。
2、 根據權利要求1所述的篩選含有外源融合基因HIV/gag/IFNa-2b的重組 痘苗病毒的方法，其特徵在於重組痘苗病毒vJ38gag/IFNot-2b表達產物為 將vJ38gag/IFNct-2b表達的蛋白產物以適當比例加入弗氏佐劑，製成具有刺 激機體產生免疫反應的蛋白抗原。
3、 根據權利要求1所述的篩選含有外源融合基因HIV/gag/IFNa-2b的重組 痘苗病毒的方法，其特徵在於所述的DNA目的基因片斷與載體的回收 根據實驗目的和DNA分子量大小分別採用凍融法、DEAE-81纖維素膜電 泳回收法、低熔點瓊脂糖凝膠回收法與透析袋法。，
4、 根據權利要求1所述的篩選含有外源融合基因HIV/gag/IFNa-2b的重組 痘苗病毒的方法，其特徵在於所述的重組表達質粒pJ38gag/IFNa-2b內含 目的基因片段gag/IFNa國2b(nt531-ntl507+nt336國ntll71+nt1507 -ntl712)，分 子量約為8.351kb。
5、 根據權利要求1所述的篩選含有外源融合基因HIV/gag/IFNa-2b的重組 痘苗病毒的方法，其特徵在於vJ38gag/IFNa-2b重組痘苗病毒株表達的 Gag蛋白能被HIV-l血清所識別，分別能與1: 10倍稀釋後的HIV-lgag陽 性血清發生較強的特異性呈色反應，其分子量為60kDa。
6、 根據權利要求1所述的篩選含有外源融合基因HIV/gag/IFNa-2b的重組 痘苗病毒的方法，其特徵在於含目的基因pJ38gag/IFNa-2b的重組痘苗病 毒經加入預先處理好的雞紅細胞後鏡下觀察，由於野生型病毒具有完整的 HA基因，所以非重組病毒感染的細胞有HA基因蛋白表達的血凝素而能 吸附雞紅細胞。肉眼觀察可見病毒蝕斑呈紅色片狀，光鏡下可見大量雞紅 細胞被吸附在病變細胞的表面。重組病毒由於外源基因片段的插入使HA 失活，其感染的細胞不能表達血凝素，故喪失了吸附雞紅細胞的能力。肉 眼觀察與非重組病毒蝕斑有明顯差異，鏡下觀察無雞紅細胞吸附，蝕斑內 的細胞多數崩解、脫落，僅剩下少量細胞融合、擁擠成堆、斑內形成空洞。
全文摘要
本發明屬於基因工程疫苗生物技術領域，提供了篩選含有外源融合基因HIV/gag/IFNα-2b的重組痘苗病毒的方法。本方法根據HIV核心蛋白胺基酸序列相對保守，具有活化B細胞的一級結構表位和活化殺傷T細胞作用的原理，構建了重組表達質粒pJ38gag/IFNα-2b，採用脂質體轉染法，以野生型痘苗病毒為介導轉基因，使pJ38gag/IFNα-2b與野生型痘苗病毒發生同源重組，利用HA特性，篩選純化出vJ38gag/IFNα-2b重組痘苗病毒株，使gag/IFNα-2b融合基因與痘苗病毒在真核細胞中共表達。小鼠實驗表明gag/IFNα-2b融合基因與痘苗病毒共表達產物能提高實驗小鼠的體液免疫與細胞免疫，表達的蛋白產物可以作為抗原進行免疫預防。本項發明為研究愛滋病病毒結構蛋白的抗原性，提供了一個獲得愛滋病病毒核心蛋白的重要途徑。
文檔編號C12N7/01GK101504411SQ20091001055
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月4日 優先權日2009年3月4日
發明者林 孫, 豔 孫, 銳 張, 王洪軍 申請人:瀋陽藥科大學