一種提高稻瘟病抗性鑑定準確性的方法
2023-06-07 05:12:31
一種提高稻瘟病抗性鑑定準確性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高稻瘟病抗性鑑定準確性的方法，該方法利用假陽性率、假陰性率，陽性預測值和陰性預測值，結合田間鑑定結果，快速提高稻瘟病抗性鑑定準確性的方法。本發明的有益效果是，減小了人為因素,提高了鑑定效率和準確性。
【專利說明】一種提高稻瘟病抗性鑑定準確性的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種稻瘟病抗性鑑定方法，特別是一種提高稻瘟病抗性鑑定準確性的 方法。
【背景技術】
[0002] 水稻是全世界最重要的糧食作物之一。我國是世界上年產稻穀最多的國家，全國 有60%以上的人口以稻米為主食。目前稻瘟病是水稻生產的主要障礙，全球每年由稻瘟病 造成的水稻產量損失足以養活6000萬人以上，造成近50億美元的損失，據估計，在1975? 1990年的16年間由稻瘟病引起的全球稻穀損失高達1.57億t，年平均1千萬t左右。90 年代以來，我國稻瘟病的年發生面積均在380萬hm 2以上，每年損失稻穀達數億公斤。近5 年南方各省和國家審定的雜交水稻組合中，對稻瘟病感至高感的佔87 %，抗性品種極少。即 使是新育成的具有抗稻瘟病的水稻品種在連續3-5代種植之後，抗病能力往往表現為衰 退，病害呈不斷加重的趨勢。
[0003] 傳統的稻瘟病抗性鑑定依賴於植株表型觀察，要求豐富的經驗和較長的時間，並 且受稻瘟病發病條件的限制，以及缺乏對抗病基因有效的追蹤方法，很難實現準確鑑定。 隨著水稻基因組和轉基因技術的發展，為稻瘟病抗性鑑定開闢了新的蹊徑。稻瘟病由真菌 子囊菌 Magnaporthe grisea (Hebert) Barr.(無性態 Pyriculariag grisea Sacc.)弓丨起， 病菌很容易發生變異，存在著不同的生理小種。我國1976年成立稻瘟病生理小種聯合試 驗小組，提出了全國統一的7個鑑別品種和鑑定方法，在稻瘟病的防治中起到了積極的作 用。然而我國的稻瘟病鑑別品種是根據其對稻瘟病菌若干菌系的反應型人為地憑經驗選擇 的，主觀性大。我國曾使用這套鑑別品種和鑑定方法從事稻瘟病生理小種監測與水稻品種 的抗性鑑定工作。由於對鑑別品種所具有的抗病基因情況了解得不多，很難從遺傳方面揭 示稻瘟病生理小種的本質差異，在實際應用過程中存在鑑別能力不強，準確度不高的局限。 近年來，抗稻瘟病的近等基因系和單基因系的育成，為在一定區域內研究稻瘟病菌的毒性 組成，探明毒力基因的結構與分布以及抗病基因的區域性利用提供了技術支撐。同時，隨著 分子生物學的發展，建立在DNA多態性基礎上的分子標記技術則為研究稻瘟病菌的遺傳宗 譜、鑑定抗病品種的抗病基因成為現實。利用高新技術研究重慶市稻瘟病原菌生理小種的 變化、分布、毒性組成以及遺傳宗譜，提高了稻瘟病監測鑑定的準確性。
[0004] 稻瘟病抗性鑑定一直採用人工接種鑑定，現在仍為主要鑑定手段。然而，傳統鑑 定技術受環境條件和發病因素的影響，鑑定人員要求有豐富的經驗，很難保證鑑定的準確 性。採用分子鑑定與人工田間接種鑑定相結合的方法，提高了鑑定準確性和效率。目前為 止，該項技術未見報導。多年來，稻瘟病抗性鑑定都是人工接種，根據表型人為主觀評判， 不能從分子角度進行實質性鑑定。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是為了解決上述問題，設計了一種提高稻瘟病抗性鑑定準確性的方 法。
[0006] 實現上述目的本發明的技術方案為，一種提高稻瘟病抗性鑑定準確性的方法，該 方法包括如下步驟：
[0007] (1)、以育69-1為母本以及Lac23為父本進行雜交，獲得Fi代雜交種子500粒，對 Fi代種子進行培育獲得F2代植株群體，F2代植株群體按16. 5cmX26. 4cm的單株面積種植， 每12株為一行，每行間的走道寬67cm,然後通過單粒群體加代自交的方式繁殖至F8R，獲 得重組自交系群體297株；（2)、在分櫱期採集F8代及親本葉片，採用改良CTAB法提取總 DNA。利用Pi-1基因附近的SSR標記，以育69-1和Lac23的DNA為模板，在雙親之間篩選出 差異標記5個，在F8代重組自交系中選擇與Lac23標記一致的單株；（3)、對F8代群體稻瘟 病田間鑑定，病圃通過人工輔助接種與田間自然誘發相結合進行葉瘟、穗頸瘟的抗性鑑定， 稻瘟病田間分級標準按中華人民共和國國家標準（GB/T1579-1995)中的稻瘟病調查和測 報標準進行；(4)、利用分子鑑定數據，計算出假陽性率與假陰性率，陽性預測值與陰性預 測值。陽性預測值是指分子實驗檢驗出的陽性條帶中所含有的田間抗病材料比率，以RM224 為例，比率為12/31。陰性預測值是指分子實驗中檢驗出陰性條帶內含有除去田間不抗病 的材料的比例，以RM224為例，比率為（266-52)/266,然後通過陽性預測值X陰性預測值/ 假陽性率X假陰性率計算出標記診斷性試驗評價值，比較5個標記在稻瘟病抗性鑑定中的 優先順序，結合田間鑑定結果驗證分子鑑定結果的準確性。
[0008] 其中，所述對匕代種子進行培育獲得F2代植株群體是指對獲得的匕雜交種子進 行混種。所述單粒群體加代自交是指在F2代植株群體中隨機選擇500株，每株只收1粒種 子，F3再次進行混種得到F4代植株群體，F4代植株群體每株收1粒種子，然後選取一粒F4代 種子自交繁殖至F8代。所述用於分子鑑定的引物序列組成如下表所示：
[0009]
【權利要求】
1. 一種提高稻瘟病抗性鑑定準確性的方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟： (1) 、以育69-1為母本以及Lac23為父本進行雜交，獲得F1代雜交種子500粒，對F1代 種子進行培育獲得F2代植株群體，F2代植株群體按16. 5cmX26. 4cm的單株面積種植，每12 株為一行，每行間的走道寬67cm，然後通過單粒群體加代自交的方式繁殖至F8代，獲得重組 自交系群體297株； (2) 、在分櫱期採集F8代及親本葉片，採用改良CTAB法提取總DNA。利用Pi-I基因附 近的SSR標記，以育69-1和Lac23的DNA為模板，在雙親之間篩選出差異標記5個，在F8代 重組自交系中選擇與Lac23標記一致的單株； (3) 、對F8R群體稻瘟病田間鑑定，病圃通過人工輔助接種與田間自然誘發相結合 進行葉瘟、穗頸瘟的抗性鑑定，稻瘟病田間分級標準按中華人民共和國國家標準（GB/ T1579-1995)中的稻瘟病調查和測報標準進行； (4) 、利用分子鑑定數據，計算出假陽性率與假陰性率，陽性預測值與陰性預測值，然 後通過陽性預測值X陰性預測值/假陽性率X假陰性率計算出標記診斷性試驗評價值， 比較5個標記在稻瘟病抗性鑑定中的優先順序。結合田間鑑定結果驗證分子鑑定結果的準 確性。
2. 根據權利要求1所述的提高稻瘟病抗性鑑定準確性的方法，其特徵在於，所述對F1 代種子進行培育獲得F2代植株群體是指對獲得的F1雜交種子進行混種。
3. 根據權利要求1所述的提高稻瘟病抗性鑑定準確性的方法，其特徵在於，所述單粒 群體加代自交是指在F2代植株群體中隨機選擇500株，每株只收1粒種子，F3再次進行混 種得到F4代植株群體，F4代植株群體每株收1粒種子，然後選取一粒F4代種子自交繁殖至 F8代。
4. 根據權利要求1所述的提高稻瘟病抗性鑑定準確性的方法，其特徵在於，所述用於 分子鑑定的引物序列組成如下表所示：
【文檔編號】A01H1/04GK104429928SQ201410699984
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月27日 優先權日:2014年11月27日
【發明者】趙正武, 姚南, 鄧小書, 唐安軍, 羅安才 申請人:重慶師範大學