一種生產DL‑色氨酸飼料添加劑的方法與流程
2023-06-04 20:07:26 5
本發明屬於色氨酸製備技術領域，具體為一種生產L-色氨酸飼料添加劑的方法。
背景技術：
胺基酸類飼料添加劑因作用重大，價格較高，目前大多數為進口產品。豬的第一、第二限制性胺基酸為賴氨酸和蛋氨酸 ；雞的第一、第二限制性胺基酸則剛好與之相反。而色氨酸是繼賴氨酸、蛋氨酸之後的主要限制性胺基酸，其在自然界含量甚少，具有多種重要的生理功能。由於目前我國配合飼料中大量添加賴氨酸和蛋氨酸，使色氨酸處於相對缺乏的狀態，需求量呈上升趨勢 ；同時由於色氨酸的發酵產酸率很低，難以工業化大量生產，導致其價格高昂，目前需要大量進口。
色氨酸的生產方法主要有早期的化學合成法和蛋白質水解法，以及後來發展起來 的微生物法。其中微生物法隨著研究的不斷深入，已經走向實用並且處於主導地位。微生 物法大致可分為直接發酵法、微生物轉化法和酶法。由於重組 DNA 技術在微生物育種中的 應用，為優良的色氨酸生產菌株的篩選和產酸水平的提高提供了可靠的技術保障，使微生 物直接發酵法生產色氨酸成為一種廉價的工業工業化生產方法。運用於色氨酸生產的菌種 有穀氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、北京棒桿菌等。
近年來，隨著蛋氨酸、賴氨酸的大量飼料化應用，色氨酸在飼料添加劑上的應用日益廣泛。在我國對直接發酵法生產色氨酸雖作了一些研究工作，但發酵產酸水平較低。
技術實現要素：
針對現有技術存在的問題，本發明提供一種成本低廉、質量安全、產率高的生產L-色氨酸飼料添加劑的方法，具體技術方案如下：
一種生產L- 色氨酸飼料添加劑的方法，包括以下步驟：
A、L- 色氨酸高產菌株的培育
以穀氨酸棒桿菌為出發菌株，通過對其進行紫外、亞硝酸鈉、硫酸二乙酯以及亞硝基胍誘變以及一系列初篩和復篩得到高產穩定的菌株；
B、將高產穩定的菌株放入培養基，在設定的發酵培養工藝條件下進行大規模發酵培養，獲得L-色氨酸發酵培養液；
所述種子培養基各組分的重量比為：葡萄糖6-8，硫酸銨0.3-0.4，玉米漿5-6，酵母膏1.2-1.5，硫酸鎂0.02-0.03，磷酸二氫鉀0.2-0.3，磷酸氫二鉀0.1-0.2，pH7.0-7.5；
所述發酵培養基各組分的重量比為：蔗糖5-7，磷酸二氫鉀0.2-0.3，磷酸氫二鉀 0.13-0.15，硫酸鎂0.08-0.12，硫酸銨0.8-1.2，玉米漿5-6，硫酸亞鐵0.0013-0.0015，硫酸錳0.0013-0.0015，硫酸銅0.0006-0.0007，L- 酪氨酸0.035-0.045，鹽酸硫胺0.00004-0.000045，pH7.0-7.5；
C、L-色氨酸的提取
將L-色氨酸發酵液升溫滅菌、調酸後，經管式超濾膜過濾得過濾清液和過濾濃液，超濾膜過濾清液經蒸發濃縮、結晶得L-色氨酸晶體和結晶母液，L-色氨酸晶體溶解後並經卷式超濾膜過濾脫色，卷式超濾膜的脫色液經蒸發濃縮、結晶、烘乾得L-色氨酸；
D、卷式超濾膜濃縮液兩次結晶，母液乾燥後與飼料載體混合配製成混合飼料。
優選的，所述穀氨酸棒桿菌為LZS-1和LZS-2。
優選的，所述種子培養基各組分的重量比為：葡萄糖7，硫酸銨0.35，玉米漿5，酵母膏1.4，硫酸鎂0.02，磷酸二氫鉀0.25，磷酸氫二鉀0.15，pH7.2；
所述發酵培養基各組分的重量比為：蔗糖5，磷酸二氫鉀0.25，磷酸氫二鉀 0.13，硫酸鎂0.08，硫酸銨1.0，玉米漿5，硫酸亞鐵0.0013，硫酸錳0.0013，硫酸銅0.0006，L-酪氨酸0.04，鹽酸硫胺0.00004，pH7.2。
優選的，發酵培養工藝為，將高產穩定的菌種以 10％的接種量接入發酵培養基，控制溫度 33-35℃，添加氨水調節 pH7.0-7.5，添加消泡劑，通氣量200L/h，轉速與溶氧聯動，控制溶氧 30％，分批高濃度補糖。
優選的，分批高濃度補糖，補糖濃度為300g/L，補糖時間為每12小時補一次。
本發明根據色氨酸代謝路徑，設計誘變譜，通過不同誘變劑誘變篩選，得到產酸 L-色氨酸量為39.16g/L的菌株，並將 L-色氨酸發酵液應用於飼料添加劑。液態生產的 L-色氨酸飼料添加劑具有成本低廉、質量安全、動物吸收利用率高，可改善畜禽動物飼料中胺基酸平衡，提高飼料利用率與蛋白質合成。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
實施例1
1、L- 色氨酸的高產菌的選育與生物學特性
對出發菌穀氨酸棒桿菌LZS-1和LZS-2進行紫外、亞硝酸鈉、硫酸二乙酯以及亞硝基胍誘變以及一系列初篩和復篩，得到產酸L-色氨酸量為38.27g/L的菌株。該菌為酪氨酸營養缺陷型，對6-氟色氨酸、5-甲基色氨酸、5-氟色氨酸、4-氟苯丙氨酸、磺胺胍和肉桂酸表現出不同程度的抗性。
(1)、紫外誘變
在固定紫外燈40瓦，距離20cm的條件下，經過60s的紫外照射誘變。
(2)、亞硝酸鈉誘變
固定NaNO2誘變濃度為0.03mol/L，經過360s的誘變。
(3)、硫酸二乙酯(DES)誘變
以25％Na282O3水溶液為誘變劑，經過30min誘變後。
(4)、亞硝基胍 (NTG) 誘變
固定誘變條件NTG的濃度為100μg/mL，室溫下，誘變20min。
(5)、誘變菌JMU-N4-102抗性表型分析
對經過上述一系列誘變篩選，最終得到的高產突變菌進行抗性表型實驗分析，經過在添加不同濃度、不同藥物平板上，該菌對所實驗的藥物6-氟色氨酸、5-甲基色氨酸、4-氟苯丙氨酸、磺胺胍和肉桂酸均表現出不同程度的抗性。
2、L-色氨酸的規模化生產
將高產穩定的菌株放入培養基，在設定的發酵培養工藝條件下進行大規模發酵培養，獲得L-色氨酸發酵培養液。
所述種子培養基各組分的重量比為：葡萄糖6，硫酸銨0.35，玉米漿5，酵母膏1.2，硫酸鎂0.03，磷酸二氫鉀0.2，磷酸氫二鉀0.1，pH7.0；
所述發酵培養基各組分的重量比為：蔗糖6，磷酸二氫鉀0.3，磷酸氫二鉀0.15，硫酸鎂0.12，硫酸銨1.2，玉米漿6，硫酸亞鐵0.0015，硫酸錳0.0015，硫酸銅0.0007，L-酪氨酸0.045，鹽酸硫胺0.000045，pH7.0。
發酵培養工藝為，將高產穩定的菌種以 10％的接種量接入發酵培養基，控制溫度 33-35℃，添加氨水調節 pH7.0-7.5，添加消泡劑，通氣量200L/h，轉速與溶氧聯動，控制溶氧 30％，分批高濃度補糖。補糖濃度為300g/L，補糖時間每12小時一次。
3、L-色氨酸的提取
將L-色氨酸發酵液升溫滅菌、調酸後，經管式超濾膜過濾得過濾清液和過濾濃液，超濾膜過濾清液經蒸發濃縮、結晶得L-色氨酸晶體和結晶母液，L-色氨酸晶體溶解後並經卷式超濾膜過濾脫色，卷式超濾膜的脫色液經蒸發濃縮、結晶、烘乾得L-色氨酸。
4、L-色氨酸的飼料添加劑製備及應用
卷式超濾膜濃縮液兩次結晶，母液乾燥後與飼料載體混合配製成混合飼料。
在肉雞飼料中加入重量百分比0.05％的L-色氨酸，肉仔雞飼料配方如下(重量百分比)：玉米58.8、豆粕30.8、大豆油2.5、磷酸氫鈣1.4、食鹽0.3、石粉1.2、L-色氨酸發酵液5。將此配料按比例攪拌均勻，飼養1周齡肉仔雞，飼餵4周後，肉雞穩定生長，與飼餵未添加L-色氨酸飼料的對照組相比，實驗組肉雞的採食量增加，肉雞攻擊性降低，抗病率增強，仔雞增重率比對照組提高11.16％。
實施例2
與實施例1不同在於：
所述種子培養基各組分的重量比為：葡萄糖7，硫酸銨0.35，玉米漿5，酵母膏1.4，硫酸鎂0.02，磷酸二氫鉀0.25，磷酸氫二鉀0.15，pH7.2；
所述發酵培養基各組分的重量比為：蔗糖5，磷酸二氫鉀0.25，磷酸氫二鉀 0.13，硫酸鎂0.08，硫酸銨1.0，玉米漿5，硫酸亞鐵0.0013，硫酸錳0.0013，硫酸銅0.0006，L-酪氨酸0.04，鹽酸硫胺0.00004，pH7.2。
實施例3
與實施例1不同在於：
所述種子培養基各組分的重量比為：葡萄糖8，硫酸銨0.4，玉米漿6，酵母膏1.5，硫酸鎂0.03，磷酸二氫鉀0.3，磷酸氫二鉀0.2，pH7.5；
所述發酵培養基各組分的重量比為：蔗糖5.5，磷酸二氫鉀0.2，磷酸氫二鉀 0.14，硫酸鎂0.10，硫酸銨0.8，玉米漿5.5，硫酸亞鐵0.0014，硫酸錳0.0014，硫酸銅0.0006，L- 酪氨酸0.035，鹽酸硫胺0.00004，pH7.5。