厚垣孢輪枝孢zk7菌株的特異性分子標記及其應用的製作方法
2023-06-04 17:22:01 3
專利名稱：厚垣孢輪枝孢zk7菌株的特異性分子標記及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及厚垣孢輪枝孢ZK7菌株的特異性分子標記及其應用，屬分子生物學技術領域。
背景技術：
根結線蟲(Meloidogyne spp.)是植物寄生線蟲的重要類群之一，僅對世界上重要的經濟作物每年造成的損失就高達數百億美元(Barker et al.，1986)，是世界許多國家菸草生產的主要限制因素之一。在我國各大煙區造成了嚴重危害，且日趨嚴重，僅雲南省發病面積就達40餘萬畝，病株造成菸葉減產30～50％(李天飛等，1994；楊銘等，1995)。由於生產上缺乏抗性品種，農作物複種指數高，化學殺線劑的使用受到限制及現代農業可持續發展的需要，使根結線蟲的生物防治日益受到重視。
但是在生物防治過程中，迄今世界上研究開發的所有的生防製劑均不同程度的存在防效不穩定的問題。本發明人前期申請的「一種微生物及其生產生物殺線蟲製劑的方法」(申請號99117391.0)，就是利用厚垣輪枝菌為出發菌株，研製開發了一種防治根結線蟲的生物農藥，目前開發的產品—線蟲必克已經大量上市。但在產品的推廣中仍不同程度的存在防效不穩定的問題，因此限制了線蟲生物防治的推廣應用。
造成生防製劑防效不穩定問題的主要原因是缺乏對生防菌生態學知識的了解。由於土壤是一個複雜的生態環境，要進行生防菌田間生態學研究首先必須解決生防菌田間快速檢測問題。儘管許多學者對如何檢測土壤特定的生防菌株進行了不懈的努力，針對不同的生防菌株研究開發了許多方法。如使用選擇性和半選擇性培養基、孢子回收技術、最大可能記數技術、酶聯免疫分析、單克隆抗體技術等。在植物寄生線蟲生防真菌的研究中，廣泛使用線蟲被寄生的數量來評估生防真菌的數量。但上述方法均存在一定的局限性，對生防真菌的檢測過程中靈敏度和準確性不高，或者只能局限於特定的環境條件使用，不能準確客觀地反映生防菌在自然環境中的定殖、存活及消長規律。
同時由於目前上市的線蟲生防產品多為活菌體生產，消費者在使用時非常容易從產品分離出生產菌株。獲得生產菌株後，即可仿造出同類產品，這對於原始創新是非常不公平的。因此，開發一種有效的線蟲生防菌分子標記及檢測方法，不但有利於跟蹤研究生防菌株在土壤中消長，提高防效，更可通過標記，保護自主智慧財產權。
發明內容
本發明的目的在於通過對根結線蟲生防菌ZK7菌株的特異性分子標記及其檢測，提供一種快速鑑別和檢測生防菌ZK7菌株的方法。
本發明採用的真菌是厚垣孢輪枝孢Verticillium chlamydosporium ZK7菌株，該菌株已於1999年9月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號CGMCC NO.0418。以該菌研製開發的微生物殺線蟲劑——線蟲必克已獲國家臨時農藥登記，登記號LS 20011571。
本發明是這樣實現的通過隨機擴增DNA多態性(RAPD)PCR擴增技術對ZK7菌株和用為對照的同種不同菌株及土壤中常見真菌進行分子指紋分析，對ZK7菌株和對照菌株的分子指紋進行分析比較，獲得ZK7菌株的RAPD特異性DNA片段Vc1200和Vc2000，進行回收、純化，克隆和測序。具體特徵為通過引物OPL-02(5′-TGG GCG TCA A-3′)擴增出一條1200bp的ZK7菌株特有的DNA片段，該片段命名為Vc1200；通過引物OPD-05(5′-TGA GCG GAC A-3′)擴增出一條2000bp的ZK7菌株特有的DNA片段，該片段命名為Vc2000；特異性DNA片段Vc1200鹼基序列長度為1168bp，特異性DNA片段Vc2000鹼基序列長度為1987bp；擴增DNA片段Vc1200的特異性引物及鹼基序列為FVc1200(5′→3′)TGG GCG TCA AAG GAG TGG CRVc1200(5′→3′)TGG GCG TCA ATA CTT GAG AG擴增DNA片段Vc2000的特異性引物及鹼基序列為FVc2000(5′→3′)TGA GCG GAC AGA GTG GAC TRVc2000(5′→3′)TGA GCG GAC AAT AGA GCC GA根據該特異性DNA片段序列設計特異性SCAR-PCR引物，對施用ZK7菌株的自然環境土壤提取的DNA進行PCR擴增，特異性檢測ZK7菌株在自然環境土壤中的存在與否及其種群數量。同時將擴增出的ZK7菌株特異性DNA片段Vc1200和Vc2000進行地高辛標記製成雜交探針，利用標記探針對施用ZK7菌株的自然環境土壤提取的DNA進行斑點雜交，特異性檢測ZK7菌株在自然環境土壤中的存在與否及其種群數量。
本發明具有能對DNA分子進行快速鑑別和檢測的功能，為該菌株的生態學研究提供科學、高效研究手段。此外，當該菌株被非法使用和生產時，可利用該特異性引物進行準確鑑別，成為解決法律糾紛有力證據。
圖1為特異性DNA片段Vc1200的測序鹼基序列。
圖2為特異性DNA片段Vc2000的測序鹼基序。
圖3特異性引物FVc1200和RVc1200對ZK7菌株的PCR檢測結果。
圖4特異性引物FVc2000和RVc2000對ZK7菌株的PCR檢測結果。
圖5特異性DNA片段Vc1200標記探針對ZK7菌株斑點雜交檢測結果。
圖6特異性DNA片段Vc2000標記探針對ZK7菌株斑點雜交檢測結果。
具體實施例方式下面用實例來進一步詳述本發明，但本發明的內容並不局限於此。
1、特異性DNA片段的獲得通過培養ZK7菌株和對照菌株純培養物菌絲體，分別提取其基因組DNA，用通用引物進行PCR擴增，篩選出對所有供試菌株具有DNA多態性的引物。對擴增出的DNA多態性進行比較，其中引物OPL-02(5′-TGG GCG TCA A-3′)擴增出一條大小約為1200bp的ZK7菌株特有的DNA片段，該片段命名為Vc1200；引物OPD-05(5′-TGA GCG GAC A-3′)擴增出一條大小約為2000bp的ZK7菌株特有的DNA片段，該片段命名為Vc2000。
2、特異性DNA片段序列測定在紫外觀察儀下分別切取電泳後瓊脂糖凝膠上特異性DNA片段Vc1200和Vc2000，用QIAquick Gel Extraction Kit回收純化該DNA片段。將該片段分別用pGEM-T-Easy Vector Systems試劑盒進行克隆，通過藍白斑平板篩選重組克隆菌落，並製備重組克隆質粒DNA，電泳檢測其分子量大小，確定特異性DNA片段單拷貝插入的重組質粒後，將該重組質粒送商業測序公司測序。測序結果表明，特異性DNA片段Vc1200鹼基序列長度為1168bp(附圖1)，特異性DNA片段Vc2000鹼基序列長度為1987bp(附圖2)。
3、特異性引物設計根據SCAR-PCR技術原理，分別以特異性DNA片段Vc1200和Vc2000的兩端鹼基序列作為特異性引物的上遊引物和下遊引物。
擴增DNA片段Vc1200的特異性引物及鹼基序列為FVc1200(5′→3′)TGG GCG TCA AAG GAG TGG CRVc1200(5′→3′)TGG GCG TCA ATA CTT GAG AG擴增DNA片段Vc2000的特異性引物及鹼基序列為FVc2000(5′→3′)TGA GCG GAC AGA GTG GAC TRVc2000(5′→3′)TGA GCG GAC AAT AGA GCC GA4、ZK7菌株的特異性PCR檢測提取施用ZK7菌株土壤DNA，以未施用ZK7菌株土壤DNA為對照，分別用特異性引物FVc1200/RVc1200和FVc2000/RVc2000進行PCR擴增。擴增結果表明，施用ZK7菌株的土樣能分別擴增出特異性DNA片段Vc1200和Vc2000，而未施用ZK7菌株的土壤DNA無任何擴增產物(附圖3和附圖4)。
5、ZK7菌株的核酸探針檢測將特異性引物擴增的DNA片段分別用地高辛標記成探針，用提取施用ZK7菌株的土壤DNA作為模板進行斑點雜交，以未施用ZK7菌株土壤DNA為對照。雜交結果表明，施用ZK7菌株的土樣DNA出現雜交信號，而未施用ZK7菌株的土壤DNA無任何雜交信號(附圖5和附圖6)。
根據以上研究結果，由ZK7菌株特異性DNA片段Vc1200和Vc2000的鹼基序列設計的特異性引物FVc1200/RVc1200和FVc2000/RVc2000可以對該菌株進行特異性快速PCR檢測和斑點雜交檢測。同時還可以利用該引物進行PCR擴增確定ZK7菌株在土壤環境中的種群數量。
權利要求
1.厚垣孢輪枝孢ZK7菌株的特異性分子標記，包括特異性DNA片段的獲得、特異性DNA片段序列測定、特異性引物設計、地高辛標記製成雜交探針，其特徵在於1.1採用真菌是厚垣孢輪枝孢Verticillium chlamydosporium ZK7菌株為培養的菌絲體；1.2引物OPL-02(5′-TGG GCG TCA A-3′)擴增出一條大小約為1200bp的ZK7菌株特有的DNA片段，該片段命名為Vc1200；引物OPD-05(5′-TGA GCG GACA-3′)擴增出一條大小約為2000bp的ZK7菌株特有的DNA片段，該片段命名為Vc2000；1.3特異性DNA片段Vc1200鹼基序列長度為1168bp，特異性DNA片段Vc2000鹼基序列長度為1987bp；1.4擴增DNA片段Vc1200的特異性引物及鹼基序列為FVc1200(5′→3′)TGG GCG TCA AAG GAG TGG CRVc1200(5′→3′)TGG GCG TCA ATA CTT GAG AG；1.5擴增DNA片段Vc2000的特異性引物及鹼基序列為FVc2000(5′→3′)TGA GCG GAC AGA GTG GAC TRVc2000(5′→3′)TGA GCG GAC AAT AGA GCC GA。
2.厚垣孢輪枝孢ZK7菌株的特異性分子標記的應用，其特徵在於該特異性分子標記可應用ZK7菌株的分子鑑別和檢測。
全文摘要
本發明涉及厚垣孢輪枝孢ZK7菌株的特異性分子標記及其應用，屬分子生物學技術領域。本發明通過隨機擴增DNA多態性(RAPD)PCR擴增技術對ZK7菌株和作為對照的同種不同菌株及土壤中常見真菌進行分子指紋分析和比較，獲得ZK7菌株的RAPD特異性DNA片段Vc1200和Vc2000，進行回收、純化，克隆和測序。根據該特異性DNA片段序列設計特異性SCAR－PCR引物，對施用ZK7菌株的自然環境土壤提取的DNA進行PCR擴增。同時將擴增出的ZK7菌株特異性DNA片段Vc1200和Vc2000進行地高辛標記製成雜交探針，利用標記探針對施用ZK7菌株的自然環境土壤提取的DNA進行斑點雜交，特異性檢測ZK7菌株在自然環境土壤中的存在與否及其種群數量。本發明能快速進行分子鑑別和檢測，為該菌株的生態學研究提供科學、高效的研究手段。
文檔編號C12Q1/68GK1514021SQ0313531
公開日2004年7月21日 申請日期2003年6月27日 優先權日2003年6月27日
發明者張克勤, 祝明亮, 周薇 申請人:雲南大學