一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法
2023-06-04 03:41:01 2
專利名稱：一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法
技術領域：
本發明涉及一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，可用於降血脂藥物中的研究和生產，屬於心血管藥物技術領域。
背景技術：
心血管疾病已是人類死亡的主要原因之一，其發病率與死亡率均高居所有疾病前列。在上世紀中葉工業化國家出現了心血管疾病大流行，心血管疾病死亡人數佔了總死亡人數的一半。從絕對數看，我國是心血管疾病的大國。而且隨著人民生活水平的不斷提高，生活方式與飲食習慣的改變，使各種心血管疾病的發生率正趨於上升。經研究證實心血管疾病的主要病理基礎為動脈粥樣硬化，高血脂症是導致動脈粥樣硬化的首要因素，因此降脂藥在減少心血管疾病發病率方面的重要性已引起人們的關注。
在眾多類型的降血脂藥物中，上世紀八十年代初發展起來的一類羥甲基戊二醯輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，即他汀類藥物，由於它們降低膽固醇的高效性，抑制膽固醇合成的高度選擇性以及低毒性，已成為心血管藥物研製中最活躍，發展最迅速的領域。其中普伐他汀鈉(pravastatin sodium)是近年發展起來的一種新型他汀類降血脂藥物，由於其高效低毒性，療效顯著，耐受性好等優點，被公認為該類藥物中最有發展前途的一種。
普伐他汀是由其前體美伐他汀(compactin)經轉化菌羥基化得到，美伐他汀由微生物發酵產生，其結構式為 C23H36O6美伐他汀的質量直接影響轉化菌的轉化效率和普伐他汀的純度，同時它也是普伐他汀的主要生產成本來源。因此製備低成本、高質量的美伐他汀對提高普伐他汀的得率和純度，降低生產成本具有重要意義。目前美伐他汀的製備方法大多採用有機溶劑萃取發酵液，高溫下回流濃縮使美伐他汀閉環，然後低溫下結晶純化。這種方法製備的美伐他汀閉環對許多普伐他汀轉化菌有毒性，無法直接添加，而且生產能耗大，成本高，不利於普伐他汀的大規模生產。
發明內容
本發明的目的是提供一種生產能耗小、成本低、得率高、最終生產可直接用普伐他汀的從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法。
為實現以上目的，本發明的技術方案是提供一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特點在於含有美伐他汀的發酵液經過濾後，用水解酶處理，然後真空濃縮，再在酸性條件下將美伐他汀萃取到疏水性有機溶劑中，有機溶劑用弱酸性緩衝液洗滌後，真空濃縮至美伐他汀濃度大於300g/L，加入親水性有機溶劑混合均勻，最後加入銨鹽或氨水，使美伐他汀轉換為銨鹽形式結晶析出。
它包括以下步驟(1).含有美伐他汀的發酵液經過濾後，用酸調節pH值為4-10；(2).在發酵液中加入水解酶，水解酶終濃度為0.1％～10％，調節pH值為6～10，在40～60℃下保溫10～20小時；(3).酶降解液在0.08Mpa、50～90℃下減壓濃縮，冷卻到低於30℃；(4).濃縮液調節pH值為3～5，加入疏水性有機溶劑，充分攪拌混合10～20分鐘，有機溶劑與濃縮液的體積比為1∶2；(5).高速離心分離有機相和水相，水相可以加入有機溶劑再萃取1～4次，棄水相，合併有機相；(6).有機相加入含有10～20％NaCl的微酸性緩衝液洗滌，有機相和緩衝液的體積比為2∶1，緩衝液pH值為5～7，高速離心分離水相和有機相，棄水相，重複洗滌有機相1～2次；(7).有機相加入無水Na2SO4，攪拌10～20分鐘，然後過濾，在0.08MPa，30～90℃下真空濃縮至美伐他汀含量為250～350g/L；(8).濃縮液冷卻到低於30℃，加入親水性有機溶劑，有機溶劑終濃度50～95％，邊攪拌邊加入銨鹽或氨水，使美伐他汀以銨鹽形式結晶析出；(9).過濾收集美伐他汀銨鹽晶體，用親水性有機溶劑洗滌晶體，在40-60℃下真空乾燥，HPLC檢測美伐他汀純度大於94％，得率大於80％；(10).美伐他汀銨鹽可進一步通過重結晶提高純度，最終得到的美伐他汀銨鹽純度大於98％。
本發明所述的微生物可以是Penicillium sp.，Penicilliumbrevicompactin，Penicilmyces.sp.，Trichoderma longibraiatum，Hyphomyceschrisopomus，penicillium citrium其中之一或它們的混合物；所述的水解酶可以是枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶其中之一或它們的混合物；所述的疏水性有機溶劑可以是乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸丙酯、富馬酸乙酯、丁甲酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯其中之一或它們的混合物；所述的微酸性緩衝液可以是KH2PO4、NaH2PO4其中之一或它們的混合物；所述的親水性有機溶劑可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異戊醇、辛醇、丙酮其中之一或它們的混合物；所述的銨鹽或氨水，銨鹽可以是NH4CL、(NH4)2SO4、NH4Ac，NH4NO3其中之一或它們的混合物。
本發明的優點是美伐他汀以銨鹽形式在常溫下結晶純化，生產能耗小，成本低，得率高，純化得到的高純度的美伐他汀銨鹽，純度不低於98％，對普伐他汀轉化菌無毒性，可直接用於普伐他汀生產。
具體實施例方式下面對本發明提出的一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐的方法的實施例作進一步詳細描述。
實施例1(1).5L發酵濾液，含有美伐他汀10g，用6N HCl調節pH值為8.0；(2).加入20ml枯草桿菌蛋白酶溶液，55℃保溫，攪拌12小時；(3).將酶降解液在80℃、0.08MPa下真空濃縮至50ml，冷卻到低於30℃；(4).濃縮液用6N HCl調節pH值為4.0，加入25ml乙酸乙酯，充分攪拌混合15分鐘；(5).高速離心分離水相和有機相，水相用25ml乙酸乙酯再萃取兩次，棄水相，合併有機相；(6).有機相用40ml含15％NaCl的1％KH2PO4緩衝液，pH值為6.5，洗滌兩遍，高速離心分離水相和有機相，棄水相；(7).有機相加入0.2g無水Na2SO4，攪拌15分鐘，過濾，濾液在0.08Mpa、50℃下真空濃縮至3ml；(8).濃縮液冷卻到低於30℃，加入12ml無水丙酮，終濃度為80％，邊攪拌邊加人0.5ml 5N NH4Cl溶液，使美伐他汀銨鹽結晶析出；(9).過濾收集美伐他汀銨鹽晶體，用無水丙酮洗滌晶體，在50℃下真空乾燥，共得到美伐他汀銨鹽晶體8.8g，HPLC檢測純度為93.5％；(10).美伐他汀銨鹽晶體進一步重結晶，得到美伐他汀銨鹽晶體8.3g，HPLC檢測純度為98.5％。
實施例2(1).60L發酵濾液，含有美伐他汀175g，用6N HCl調節pH值為8.0；(2).加入200ml胰蛋白酶溶液，55℃保溫，攪拌15小時；(3).酶降解液在0.08MPa、80℃真空濃縮至5L，冷卻到低於30℃；(4).濃縮液用6N HCL調節pH值為4.0，加入25L乙酸丁酯，充分攪拌混合15分鐘；(5).高速離心分離水相和有機相，水相用25L乙酸丁酯重複萃取兩次，棄水相，合併有機相；(6).有機相用40L含有15％NaCl的1％KH2PO4緩衝液，pH值為6.5，洗滌兩遍，離心分離水相和有機相，棄水相；
(7).有機相加入1g無水Na2SO4，攪拌15分鐘，過濾，濾液在0.08Mpa、50℃下真空濃縮至550ml；(8).有機相冷卻到低於30℃，加入2200ml無水乙醇，終濃度為80％，邊攪拌邊加入20ml 2N NH4Ac溶液，使美伐他汀銨鹽結晶析出；(9).過濾收集美伐他汀銨鹽晶體，用無水乙醇洗滌晶體，在50℃下真空乾燥，共得到美伐他汀銨鹽晶體150g，HPLC檢測純度為94.2％；(10).美伐他汀銨鹽晶體進一步重結晶，得到美伐他汀銨鹽晶體143g，HPLC檢測純度為98.5％。
權利要求
1.一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特徵在於，含有美伐他汀的發酵液經過濾後，用水解酶處理，然後真空濃縮，再在酸性條件下將美伐他汀萃取到疏水性有機溶劑中，有機溶劑用弱酸性緩衝液洗滌後，真空濃縮至美伐他汀濃度大於300g/L，加入親水性有機溶劑混合均勻，最後加入銨鹽或氨水，使美伐他汀轉換為銨鹽形式結晶析出。它包括以下步驟(1).含有美伐他汀的發酵液經過濾後，用酸調節pH值為4-10；(2).在發酵液中加入水解酶，水解酶終濃度為0.1％～10％，調節pH值為6～10，在40～60℃下保溫10～20小時；(3).酶降解液在0.08Mpa、50～90℃下減壓濃縮，冷卻到低於30℃；(4).濃縮液調節pH值為3～5，加入疏水性有機溶劑，充分攪拌混合10～20分鐘，有機溶劑與濃縮液的體積比為1∶2；(5).高速離心分離有機相和水相，水相可以加入有機溶劑再萃取1～4次，棄水相，合併有機相；(6).有機相加入含有10～20％NaCl的微酸性緩衝液洗滌，有機相和緩衝液的體積比為2∶1，緩衝液pH值為5～7，高速離心分離水相和有機相，棄水相，重複洗滌有機相1～2次；(7).有機相加入無水Na2SO4，攪拌10～20分鐘，然後過濾，在0.08MPa，30～90℃下真空濃縮至美伐他汀含量為250～350g/L；(8).濃縮液冷卻到低於30℃，加入親水性有機溶劑，有機溶劑終濃度50～95％，邊攪拌邊加入銨鹽或氨水，使美伐他汀以銨鹽形式結晶析出；(9).過濾收集美伐他汀銨鹽晶體，用親水性有機溶劑洗滌晶體，在40-60℃下真空乾燥，HPLC檢測美伐他汀純度大於94％，得率大於80％；(10).美伐他汀銨鹽可進一步通過重結晶提高純度，最終得到的美伐他汀銨鹽純度大於98％。
2.根據權利要求1所述的一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特徵在於，所述的微生物可以是Penicillium sp.，Penicilliumbrevicompactin，Penicilmyces sp.，Trichoderma longibraiatum，Hyphomyces chrisopomus，penicillium citrium其中之一或它們的混合物；
3.根據權利要求1所述的一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特徵在於，所述的水解酶可以是枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶其中之一或它們的混合物；
4.根據權利要求1所述的一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特徵在於，所述的疏水性有機溶劑可以是乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸丙酯、富馬酸乙酯、丁甲酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯其中之一或它們的混合物；
5.根據權利要求1所述的一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特徵在於，所述的微酸性緩衝液可以是KH2PO4、NaH2PO4其中之一或它們的混合物；
6.根據權利要求1所述的一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特徵在於，所述的親水性有機溶劑可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異戊醇、辛醇、丙酮其中之一或它們的混合物；
7.根據權利要求1所述的一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，其特徵在於，所述的銨鹽或氨水，銨鹽可以是NH4CL、(NH4)2SO4、NH4Ac，NH4NO3其中之一或它們的混合物。
全文摘要
本發明涉及一種從微生物發酵液中純化普伐他汀前體美伐他汀的方法，可用於降血脂藥物中的研究和生產，其特點在於，含有美伐他汀的發酵液經過濾後，用水解酶處理，然後真空濃縮，再在酸性條件下將美伐他汀萃取到疏水性有機溶劑中，有機溶劑用弱酸性緩衝液洗滌後，真空濃縮至美伐他汀濃度大於300g/L，加入親水性有機溶劑混合均勻，最後加入銨鹽或氨水使美伐他汀轉換為銨鹽形式結晶析出。本發明的優點是美伐他汀以銨鹽形式在常溫下結晶純化，生產能耗小，成本低，得率高，純化得到的高純度的美伐他汀銨鹽，純度不低於98％，對普伐他汀轉化菌無毒性，可直接用於普伐他汀生產。
文檔編號C07C67/00GK1504454SQ02151068
公開日2004年6月16日 申請日期2002年12月5日 優先權日2002年12月5日
發明者梅民權, 季曉銘, 李嚴, 姚勇, 卓中浩 申請人:上海天偉生物製藥有限公司