一株能夠降解土壤殘留二氯喹啉酸的寡養單胞菌的製作方法
2023-06-04 12:59:26
本發明屬於環境汙染微生物處理技術領域，具體涉及一株能夠降解土壤殘留二氯喹啉酸的寡養單胞菌。
背景技術：
菸草（nicotianatabacum）屬茄科一年生或有限多年生草本植物，起源於南美洲，目前種植遍布世界各地。菸草是一種特殊的經濟作物，我國自1982年實行菸草專賣制度以來，菸草行業得到長足發展並成為國民經濟的一個重要支柱產業。菸草在我國南北各省區均有種植，其主要用途為加工菸葉生產捲菸。因此，優質的菸葉是菸草生產的重要目標，如何保證優質的菸葉也是菸農關心的重要問題。在福建，菸草種植主要以稻煙輪作方式為主，然而上茬作物水稻常用的農藥如除草劑的使用，嚴重影響了後茬菸草的生長。菸草對除草劑較為敏感，隨著除草劑在水稻田的廣泛使用，菸草生產受到除草劑藥害的現象時有發生，給菸草生產帶來極大的危害。
已有研究表明二氯喹啉酸施用後，在美國阿肯色州有研究者檢測到水稻田附近水域二氯喹啉酸的殘留量可達µg/l級;利用測滲計模擬水稻田施用二氯喹啉酸的環境行為，結果表明95%殘留在水稻田的30cm表層土壤中。土壤中殘留的二氯喹啉酸會影響菸草植株的畸形生長，導致新葉向葉背捲縮，隨後逐漸發展成線狀鼠尾狀葉形。由於二氯喹啉酸的藥害，烤菸的產量和產值均明顯降低，嚴重危害時可降低80%以上，甚至絕收。
微生物法降解殘留農藥具有環境友好，無汙染，高效等特點，因此利用生物進行環境修復是近年來的研究熱點。本發明通過田間長期使用二氯喹啉酸的土壤中分離篩選獲得降解菌株，本發明所採用的菌株為泛菌屬菌株，目前尚未見泛菌屬用於土壤殘留二氯喹啉酸降解的報導；本發明菌株來源於土壤，具有環境友好的特點。採用生物法解除煙田殘留除草劑二氯喹啉酸不僅能降低藥害帶給菸草的經濟損失，而且也對保護環境，淨化土壤有不可小覷的意義。
技術實現要素：
為解決上述二氯喹啉酸在土壤中殘留導致菸草產量和產值降低的問題，本發明提供一株能夠降解土壤殘留二氯喹啉酸的寡養單胞菌。該菌株可有效降解土壤中殘留的二氯喹啉酸，從而提高菸草產量。
為實現上述目的，本發明採用如下技術方案：
一株能夠降解土壤殘留二氯喹啉酸的寡養單胞菌，經鑑定，所述菌株為寡養單胞菌j3（stenotrophomonassp.j3），已保藏於中國典型培養物保藏中心cctcc，地址：中國武漢武漢大學，郵政編碼：430072；保藏日期為2017年3月16日，保藏編號為cctccno:m2017128。
本發明菌株j3通過如下方法富集得到：
本實驗從福建煙田採集土壤，利用富集法篩選獲得，其篩選過程如下：
（1）二氯喹啉酸降解菌的富集：取0.1g土壤與100mlmm培養基混合，並加入二氯喹啉酸使其終濃度為100µg/ml，於30℃，150r/min培養1周；取培養液1ml加入100ml含同樣濃度除草劑的新鮮培養基中，同時於固體培養基劃線以確認有細菌生長，同樣條件培養1周；連續轉代培養10次後，經平板劃線分離，獲得單菌落菌株。
（2）液相色譜測定該菌降解率：將所得菌株分別置於含有5µg/ml二氯喹啉酸和不含二氯喹啉酸的mm培養基中培養，以不加菌液只含相同濃度二氯喹啉酸的mm培養基為參照，利用高效液相色譜法進行測定；取樣時間分別為第6d和第23d，樣品體積為1ml；將樣品在8000r/min條件下離心10min,上清液經0.22µm濾膜過濾後用於hplc分析，每個處理三次重複。hplc檢測條件為：固定相為c18柱（4.6×250nm，5µm，安捷倫）；流動相為甲醇+0.5%乙酸水（體積比為65:35）；流速為1.0ml/min；柱溫為30℃；檢測波長為240nm；進樣體積為10µl。
利用（2）中所述檢測條件對該菌株的二氯喹啉酸降解能力進行檢測，並通過下列公式求得其二氯喹啉酸降解率：
本發明所述的菌株j3可用於降解二氯喹啉酸。
本發明的優點在於：
本發明通過田間長期使用二氯喹啉酸的土壤中分離篩選獲得降解菌株，採用生物法降解煙田殘留除草劑二氯喹啉酸不僅能降低藥害帶給菸草的經濟損失，而且也對保護環境，淨化土壤有不可小覷的意義。
附圖說明
圖1富集法篩選可降解二氯喹啉酸的微生物菌株流程圖；
圖2j3菌落形態圖：菌落呈黃色、圓形、隆起、不透明、邊緣整齊；
圖3標準品二氯喹啉酸（5mg/l）在mm培養基及甲醇中的色譜圖：a為mm培養基，b為添加菌液的mm培養基，c為添加二氯喹啉酸的mm培養基，d為溶解在甲醇中的二氯喹啉酸；
圖4高效液相色譜法檢測二氯喹啉酸的標準曲線；
圖5mm培養基中添加菌株j3培養6d和23d後對二氯喹啉酸的降解率。
具體實施方式
實施例1菌株j3的篩選
本試驗從煙田採集土壤，利用富集法篩選可降解二氯喹啉酸的微生物菌株，過程如圖1所示。本試驗篩選得到一株可以降解土壤二氯喹啉酸的菌株，將其命名為j3；其篩選過程如下：
（1）二氯喹啉酸降解菌的富集：取0.1g土壤與100mlmm培養基混合，並加入二氯喹啉酸使其終濃度為100µg/ml，於30℃，150r/min培養1周；取培養液1ml加入100ml含同樣濃度除草劑的新鮮培養基中，同時於固體培養基劃線以確認有細菌生長，同樣條件培養1周；連續轉代培養10次後，經平板劃線分離，獲得單菌落菌株。該菌為革蘭氏陰性菌，菌落呈黃色、圓形、隆起、不透明、邊緣整齊；其菌落形態圖見圖2。
（2）液相色譜測定該菌降解率：將所得菌株分別置於含有5µg/ml二氯喹啉酸和不含二氯喹啉酸的mm培養基中培養，以不加菌液只含相同濃度二氯喹啉酸的mm培養基為參照，利用高效液相色譜法進行測定；取樣時間分別為第6d和第23d，樣品體積為1ml；將樣品在8000r/min條件下離心10min,上清液經0.22µm濾膜過濾後用於hplc分析，每個處理三次重複。hplc檢測條件為：固定相為c18柱（4.6×250nm，5µm，安捷倫）；流動相為甲醇+0.5%乙酸水（體積比為65:35）；流速為1.0ml/min；柱溫為30℃；檢測波長為240nm；進樣體積為10µl。其色譜圖見圖3，結果表明在該條件下，可以很好的地將二氯喹啉酸的目標峰與雜質分離開。
（3）製作標準曲線：用色譜甲醇配製得到500µg/ml二氯喹啉酸標準儲備溶液，再用色譜甲醇稀釋得到0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0和10.0µg/ml二氯喹啉酸系列標準工作溶液。將標準溶液分別進樣，獲得的峰面積與藥液濃度作相關圖，求相關係數。標準曲線如圖4所示，結果表明不同濃度二氯喹啉酸與峰面積間的線性相關係數r為0.9980；表明二氯喹啉酸含量與響應值呈良好的線性關係。
利用（2）中所述檢測條件對該菌株的二氯喹啉酸降解能力進行測定，並通過下列公式求得其二氯喹啉酸降解率：
測定結果如圖5所示，表明培養6d後，菌株j3對二氯喹啉酸的降解率為10.3%；培養23d後，菌株j3對二氯喹啉酸的降解率為33.5%。由此可見菌株j3對土壤中的二氯喹啉酸具有較佳的降解能力。
實施例2分子鑑定
利用細菌16srdna通用引物fd2/rp1，通過菌落pcr擴增菌株的16srdna測序後進行對比分析鑑定菌株：
fd2：5』-agagtttgatcatggctcag-3』，
rp1：5』-acggttaccttgttacgactt-3』；
pcr反應體系：pcr反應體系為：1×pcrmix反應液（全式金生物科技有限公司，北京），0.4μm引物，並利用牙籤挑取少量菌落作為模板；
pcr反應程序：95℃預變性4min後進行32次循環，每次循環包括95℃變性30s，58℃退火30s及72℃延伸1min；最後在72℃再延伸10min。
pcr產物j3-16srdna經瓊脂糖凝膠電泳驗證後進行dna回收、測序，測序結果與genbank資料庫進行比對。結果顯示，本發明篩選所得菌株j3與genbank中的寡養單胞菌屬嗜麥芽寡養單胞菌（stenotrophomonasmaltophilia）同源性達100%，其同源序列登錄號為nr_112030.1。經鑑定，菌株為寡養單胞菌j3（stenotrophomonassp.j3），已保藏於中國典型培養物保藏中心cctcc，地址：中國武漢武漢大學，郵政編碼：430072；保藏日期為2017年3月16日，保藏編號為cctccno:m2017128。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。
sequencelisting
中國菸草總公司福建省公司
福建農林大學
一株能夠降解土壤殘留二氯喹啉酸的寡養單胞菌
3
3
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