一種厭氧降解纖維素產甲烷複合菌的製作方法

2023-06-04 09:39:26 1

專利名稱：：一種厭氧降解纖維素產甲烷複合菌的製作方法
技術領域：
：本發明涉及纖維素降解及能源化利用
技術領域：
，特別涉及一種厭氧降解纖維素產曱烷的複合菌。
背景技術：
：天然纖維類物質是地球上最豐富的生物質，除少部分被利用外，絕大多數以廢棄物的形式存在於自然環境中。為了充分開發利用這類豐富的可再生資源，早在1883年和1886年就有學者開始研究纖維素的生物降解，特別是由於近年來石油、煤等化石能源價格不斷攀升，纖維素生物轉化為新能源的問題更是得到國內外學者的廣泛關注。自然狀態下，纖維素的徹底降解是在微生物體系中由多種微生物長時間相互作用的結果，這一過程僅靠一種微生物是無法實現的。因為純培養物具有以下缺點即產酶單一，纖維素的分解產物纖維二糖與葡萄糖能夠抑制纖維素酶的活性以及阻遏纖維素酶的合成，揮發酸的積累會使培養液pH容易下降到很低而無法恢復到適合培養物生長的條件，從而使纖維類物質的轉化效率低；而且在不經過預處理和/或滅菌的情況下，利用純培養物和純酶降解木質纖維素具有一定的難度。因此，在進行纖維素大分子降解的研究過程中要考慮到微生物之間的協同作用。多菌抹混合培養，不僅產酶具有多樣性，同時可以解除產物的反饋抑制，調節培養液的pH,從而提高纖維素的轉化率。與純培養物相比，混合菌群中微生物間穩定的協同關係，對分解像纖維素這樣的生物大分子的具有不可比擬的優勢。多菌抹混合培養，多種酶協同作用，可較快和較徹底地解除產物的反饋抑制，調節培養液的pH,提高纖維素的轉化率。中國專利說明書CN1335288A公開了一種有機物快速腐熟菌劑，該發明將具有高效穩定分解纖維素能力的混合菌系用於堆肥，其注重纖維素的分解率，對纖維素的去向並不十分關心。中國專利說明書CN1896254A公開了一種混合菌群降解發酵木質纖維素類物質生產酒精的方法，該發明的技術方案是將纖維素降解的產物轉化為酒精。2008年，農業部沼氣科學研究所羅輝的碩士論文《高效厭氧纖維素降解菌的篩選，複合菌系的構建及應用研究》中公開了具有降解纖維素產曱烷能力的兩個天然複合菌系，這兩個天然複合菌系均由好氧菌和厭氧菌組成，包含沼氣發酵中的三大主要功能菌群，即纖維素降解菌群、產氫產乙酸菌群和曱烷菌群，是典型以纖維素降解為主，具有較為完整的沼氣各功能糹效生物的天然複合菌系。這兩個天然複合菌系雖然都具有較強的纖維素降解能力和產曱烷能力，但是這種自然發酵物菌劑中所含的菌種是在自然的被動發酵過程中無序的集合而成的多菌聯合體，無法掌握其菌種組成，使用效果難以控制；而且這種天然複合菌系被動的遵循自然循環規律，其分解效果難以保持穩定性。
發明內容本發明所要解決的問題是提供一種能高效厭氧轉化纖維素為甲烷且效果穩定，易於控制，分解效率高的複合菌。為了解決上述問題，本發明的複合菌由以下13個菌抹組成(1)6>"/7力<3^屍er/^/"^發酵噬纖維菌，細胞呈可彎曲杆狀，兼性厭氧，有氧條件下分解纖維素產生乙酸、丙酸、琥珀酸、H2和C02等，同時可產生黃色素，菌林保藏編號ATCC19072，DSM9555;(2)北e"feCe/7咖伍氏醋酸桿菌，細胞橢圓或短杆，單生、成對偶爾成短鏈，嚴4各厭氧，氧化氬、還原C02生成乙酸，也發酵果糖和其他底物產生乙酸，菌抹保藏編號ATCC29683，DSM1030;(3)"ew7/oW6WoKw/《a77s普通脫硫弧菌，弧狀，以硫S臾鹽作為電子受體，還可以代謝碳水化合物、蛋白腖及其代謝中間產物，產生揮發酸，菌林保藏編號ATCC29579,DSM644;(4)6W/w/o鵬朋s/7aF/ge朋產黃纖維單胞菌，細長杆狀，能分解纖維素，還可以利用葡萄糖和其他碳水化合物在好氧和厭氧條件下產酸，菌抹保藏編號ATCC482，DSM20109;5(5)》"0^V"r/0/7力r/^/Fe/^溶纖維丁酸弧菌弧狀，嚴格厭氧，分解纖維素產生有機酸，同時可產生降解半纖維素的半纖維素酶，ATCC19171,DSM3071j(6)67oWr/y六孤/w/^ro^/p^^直杆，嚴格厭氧，7JC解纖維素產生乙酸、乙醇和H2等，菌4朱保藏編號ATCC35413,DSM2782;(7)C/o"ifl7咖ce/7o6/o/ar咖產纖維二糖;f炎菌，彎曲或直杆狀，水解纖維素產生纖維二糖等，菌抹保藏編ATCC15832,DSM1351;(8)fe，/〃o7s彎曲或直杆狀，水解纖維素產生乙酸、乙醇和H2等，菌抹保藏編號ATCC51846，DSM5398;(9)iy7"r。i7力湖o朋s/fe//ei沃爾夫伴生單胞菌，輕微螺杆狀，不產芽孢，分解丁酸產生乙酸和H,,與產曱烷菌互營，菌林保藏編號DSM4212;(10)#"力細塒"'朋/jarfeW巴氏甲烷八疊球菌不對稱球形，能夠不規則聚集成團，利用曱醇、三曱胺、乙酸和H2/C02生長產曱烷，菌抹保藏編號ATCC43241,DSM1538;(11)yl/e/^a/2t^reF/Z^cfer口者初於木曱》克4豆才幹菌，4豆^幹菌，單生、成對或成串，只利用H2/C02生長產甲烷，菌4朱保藏編號ATCC33747,DSM1125j(12)y(/"力a/20^A3ei^WaoY鵬/2/ae斯氏甲烷球形菌不規則球狀，單生或成對，極端嚴格厭氧，利用&/(:02和曱酸鹽生長產曱烷，要求乙酸等作為有機生長因子，菌4朱保藏編號ATCC43021，DSM3091;(13);l/e/^a/70cocci^raw/7/e/iy萬氏甲步克3求菌，》見則或不^見則5求開j,才及端嚴格厭氧，利用H2/C02和曱酸鹽生長產曱烷，菌抹保藏編號ATCC35089，DSM1224。以上菌抹均可通過德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)或美國典型培養物中心(ATCC)獲得。本發明的複合菌由13抹菌組成，按照代謝途徑的不同，可以將這13抹菌分為以下5類6厭氧纖維素分角年菌C/c^"7o7"歷pap/royo/Fe/25S67osfr兼性厭氧纖維素分解菌0",op力aga/e/7ze""刀s，其它發酵性糹田菌爿ce"&s"eW"/ffprato7/;Ze5^AT。Ki6Wora/gaWs;互營菌分/^,c^力湖a^i",/,e/;產甲》克菌#e〃M"oi^rc//M6arler/,yJ/eZ力a"o6refa'6ac/"er在含有纖維素的培養基中，上述複合菌協同作用，在降解纖維素的同時生成曱烷。具體說就是厭氧纖維素分解菌和兼性厭氧纖維素分解菌分解培養基中的纖維素，得到葡萄糖和有機酸類物質，葡萄糖和有機酸等被產氫產酸細菌進一步降解為仏、C02和乙酸等，培養基中的蛋白質及其他大分子底物被Kw/卵r/s和Jce"力a"eW咖,c^/i分解為氛基酸及其他有機酸，胺基酸作為複合菌生長的氮源進一步被分解，其他有機酸被產氫產酸細菌進一步降解為112、C02和乙酸等。上述不產曱烷的細菌可把各種複雜的有機物，如碳水化合物、蛋白質等厭氧分解生成H2、C02、NH3、乙醇、乙酸、丙酸、丁酸等，丙酸、丁S吏還可^L氫細菌和乙酸細菌分解轉化成H2、C02和乙酸，為曱烷細菌提供了合成細胞質和形成甲烷的碳前體，電子供體一_氬供體和氮源，使曱烷細菌利用這些物質最終形成甲烷。作為本發明的一種改進，13株菌抹在複合菌中的細胞數含量為0^邵A^a/e,;z7e/7^/w佔5—10%,C/as^ric^'〃/jta;/rayo/yeiW佔25—35%,"eszy/Z^Fy/jr/on/7gaW51佔1—3%,_ft/0^r/i//6r/o/7々r/so/Ke/i12.5—5°/。，Jcefo&3"er/"/s佔5-10%,/7sK/》e/L3佔1-5%,^7c^/Wd/〃///er^〃fl7s佔1-5%,C/oi""W鵬ce/7o6/聊r咖佔2.5_5%，5y/7fro/力cw脂ssW屍e/5-10%，#<^力<3刀0<3〖(;//7A///ciW佔10—15%,i^ef力a/20S";力aerasfat/tffla刀/ae5—8%，Tl/ef/a;2ococcas1Fa;Mie7/i佔2.5—5%。7本發明中菌林在複合菌中的細胞數含量的含義是指複合菌中各菌林細胞數佔複合菌總細胞數的百分含量。本發明的複合菌用於厭氧降解纖維素類物質產甲烷時，可快速高效水解纖素，加快發酵啟動，提高曱烷含量。本發明的複合菌對含纖維素的原料有較好的降解效果，以稻草原料為例，本發明的複合菌處理15天，對稻草的降解率為63.8°/到75.9%，處理30天，對稻草的降解率為79.4%到89.2%。本發明的複合菌在高效降解纖維素的同時，還可以產生曱烷。在以稻草為原料，處理30天的發酵試驗中平均每天甲烷產率可達到0.41mV天.kg'TS(TS為總固形物含量)，其中甲烷含量達64.8%。本發明的複合菌由13抹菌組成，其數量和菌抹種類確定且已知，在應用於纖維素降解產甲烷時，針對不同的纖維素類物質，如稻草、小麥秸稈、玉米秸稈、城市固體垃圾等，可以通過簡單的試驗確定不同菌林的確切配比，其效果穩定且易於控制。具體實施例方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。本發明中菌林在複合菌中的細胞數含量的含義是各菌抹細胞數佔複合菌總細胞數的百分含量。本發明中甲烷和C02的百分含量(％)是指曱烷和C02在混合氣體中的體積百分含量。本發明中TS是指纖維素中所含固形物質。實施例中"曱烷產率(m7天-kg'TS)"指每kg含纖維素的固形物經複合菌處理後，每天產生的含曱烷氣體在一個大氣壓下，25。C時的體積(m3)，"曱烷含量(％)"是指曱烷氣體的體積佔含纖維素的固形物經複合菌處理後產生的含曱烷氣體總體積的百分比，二氧化碳含量(％)是指二氧化碳氣體的體積佔含纖維素的固形物經複合菌處理後產生的含曱烷氣體總體積的百分比，降解率是指含纖維素的固形物經複合菌處理後所減少的重量佔其初始重量的百分比。實施例中菌抹在複合菌中的細胞數含量的含義是指複合菌中各菌抹細胞數佔複合菌總細胞數的百分含量。實施例1:一種厭氧降解纖維素產甲烷複合菌，由以下13林菌組成，13林菌抹在複合菌中的細胞數含量為C/^p力a^/er幼e/7"/w佔10%，C/w"j'o7咖/M/77rc^0/Fe/LS1佔25%,"/6r/o/7^r/S(9/Fe/7515%，Jce"6ac/e/7〃/zpraoc7/佔5%,^3//a/o/"(9"as/7az/^"e/2a佔1%,C/os7rW鵬ter戰/〃fl7i1佔1%,C/o"r/力.腿ce7/oWc^r咖佔2.5%,5y"/rc^力o巡aaa515%,yJ/eZ力a/2c^ai""'朋6ar上e,y佔19%,j/ef/a/ococciAS1ra/M/e7//佔2.5%。具有上述組成的複合菌接入以稻草為碳源的纖維素液體培養基中，密封靜置培養。培養15天和30天的稻草降解效果和所產生的氣體濃度結果見下表曱烷(%)C02(°/。)稻草降解率(。/)曱烷產率uv天'kgTS)15天58.641.468.60.3530天61.238.880.20.39實施例2:一種厭氧降解纖維素產曱烷複合菌，由以下13林菌組成，13株菌抹在複合菌中的細胞數含量為0^o;力a卵/e/7Be/^3/L9佔7.5%，67oWW^/'〃辺j05/^ro5^/Fe/:i"佔35%,"e57/_//bi^./)r/cra/^"ai"/s佔3%,》wO^"'"6r/0/76r/i^7i/e刀54%,Jce^6s"er/ws佔5%,Ce/7"/cwo/^i"/7a「/gei7a佔5%,67oy"油.鵬Zer/27/〃fl7s佔3%,C/oi""/o7"yz7ce//o6/o/73i7//佔5%，5ynfr6^力cw(/M51^ATe/5%,^e/"A3/c^(3rc/A3Warier/佔10%,y)/eZ力a/7o6rei^'6a"erardor//7力27/ciA佔10%,yl/efA3/2(577A2ei^s^36^/ra/7/ae5%,yl/ef力s/20COCCiAyra/M/e///佔2.5%。具有上述組成的複合菌接入以稻草為碳源的纖維素液體培養基中，密封靜置培養。培養15天和30天的稻草降解效果和所產生的氣體濃度結果見下表9tableseeoriginaldocumentpage10實施例3:一種厭氧降解纖維素產曱烷複合菌，由以下13林菌組成，13抹菌抹在複合菌中的糹田月包數含量為0^oj9力a^/er/7e/7^w佔6%,"<9S"/o7"//^/^ro5^/Ke"s佔25%,"esiz/Tbi^/^r/ora/gar/s1佔2%，5i/f/i"yp^'々r/0/7/r/5^/i^/2i14%,^c"o&2"er/湖佔100/o，Cei7w/咖(9加s/7a一e加佔5%,t7osfi"油.i;/h/ei7^油.s佔3%,C7o5^Wo7〃/bce/7(6/c^r咖佔3%,5"/i"(^力o/s(9/7asZ^/屍e7'10%,#e/"j^/7c^a_rc//2a6ari:er/佔13%,yt/e/As/Jo6reF/6a"ero_r//^///ci/ir佔10%，yl/ef力a/70-S77A3e/^s^3o7/wa/2'ae4%,vl/e/"力a;20coccwsra/m/'e///佔5%。具有上述組成的複合菌接入以稻草為碳源的纖維素液體培養基中，密封靜置培養。培養15天和30天的稻草降解效果和所產生的氣體濃度結果見下表tableseeoriginaldocumentpage10實施例4:一種厭氧降解纖維素產甲烷複合菌，由以下13抹菌組成，13林菌林在複合菌中的糹田胞數含量為0^0/力ags屍er/z/e/7/a/751佔5%,"o""V/咖iw/^rc^o/i^os佔30%,Z^yi;/屍OK/6r/(9「w7《ar/51佔1%，7"/7n'"'6"-(9/76"Wre/2i"2.5%,Jcefo6a"er/tM7,ooc///佔6%,Ce/7i77cwa3a51/7ar/ge/2a佔2%,67c^r/a7咖/"e，"Ws佔1%，6Vc^"油'咖ce/7c6/c/7sr"/z7佔30/o，5)T^ro/7力o;Haoa5"8%,y(/e/^ai20^r"'/7s力arier/佔20%,50/o，#e/A3/20coccwra/M27eh7佔3.5%。具有上述組成的複合菌接入以稻草為碳源的纖維素液體培養基中，密封靜置培養。培養l5天和30天的稻草降解效果和所產生的氣體濃度結果見下表tableseeoriginaldocumentpage11權利要求1.一種厭氧降解纖維素產甲烷複合菌，其特徵是該複合菌由以下13個菌株組成Cytophagafermentans發酵噬纖維菌，細胞呈可彎曲杆狀，兼性厭氧，有氧條件下分解纖維素產生乙酸、丙酸、琥珀酸、H2和CO2等，同時可產生黃色素，菌株保藏編號ATCC19072，DSM9555；Acetobacteriumwoodii伍氏醋酸桿菌，細胞橢圓或短杆，單生、成對偶爾成短鏈，嚴格厭氧，氧化氫、還原CO2生成乙酸，也發酵果糖和其他底物產生乙酸，菌株保藏編號ATCC29683，DSM1030；Desulfovibriovulgaris普通脫硫弧菌，弧狀，以硫酸鹽作為電子受體，還可以代謝碳水化合物、蛋白腖及其代謝中間產物，產生揮發酸，菌株保藏編號ATCC29579，DSM644；Cellulomonasflavigena產黃纖維單胞菌，細長杆狀，能分解纖維素，還可以利用葡萄糖和其他碳水化合物在好氧和厭氧條件下產酸，菌株保藏編號ATCC482，DSM20109；Butyrivibriofibrisolvens溶纖維丁酸弧菌，弧狀，嚴格厭氧，分解纖維素產生有機酸，同時可產生降解半纖維素的半纖維素酶，菌株保藏編號ATCC19171，DSM3071；Clostridiumpapyrosolvens溶紙梭菌，直杆，嚴格厭氧，水解纖維素產生乙酸、乙醇和H2等，菌株保藏編號ATCC35413，DSM2782；Clostridiumcellobioparum產纖維二糖梭菌，彎曲或直杆狀，水解纖維素產生纖維二糖等，菌株保藏編ATCC15832，DSM1351；Clostridiumtermitidis彎曲或直杆狀，水解纖維素產生乙酸、乙醇和H2等，菌株保藏編號ATCC51846，DSM5398；SyntrophomonasWolfei沃爾夫伴生單胞菌，輕微螺杆狀，不產芽孢，分解丁酸產生乙酸和H2，與產甲烷菌互營，菌株保藏編號DSM4212；Methanosarcinabarkeri巴氏甲烷八疊球菌不對稱球形，能夠不規則聚集成團，利用甲醇、三甲胺、乙酸和H2/CO2生長產甲烷，菌株保藏編號ATCC43241，DSM1538；Methanobrevibacterarboriphilicus嗜樹木甲烷短桿菌，短桿菌，單生、成對或成串，只利用H2/CO2生長產甲烷，菌株保藏編號ATCC33747，DSM1125；Methanosphaerastadtmaniae斯氏甲烷球形菌不規則球狀，單生或成對，極端嚴格厭氧，利用H2/CO2和甲酸鹽生長產甲烷，要求乙酸等作為有機生長因子，菌株保藏編號ATCC43021，DSM3091；Methanococcusvannielii萬氏甲烷球菌，規則或不規則球形，極端嚴格厭氧，利用H2/CO2和甲酸鹽生長產甲烷，菌株保藏編號ATCC35089，DSM1224。2.根據權利要求l所述的降解纖維素產曱烷複合菌，其特徵是上述13抹菌抹在複合菌中的細胞數含量分別為，0^op力3W/er/ffe/^/Ly佔5-10%,6Vo5^r/o7〃yz7/^/^/rc^o/i^yw佔25—35%,/^5^//07/6,/6>「zy/gar/s佔1—3%,^7f/r/F/6r/(9/7》"W7e/612.5-5%,Jcefc^"eW咖,007/佔5-10%,Ce7/〃/咖。/Lss/7a"ge/a佔1-5%,C/c^Wd/咖fei7ff/〃fl7s佔1-5%，C/o"rW咖ce/7c^/o/a,〃yT7佔2.5-5%,分/7"(9/7力cw。/L3i1^b/Z"e/5-10%,yJ/e^a"05"ar"'/2a^3riren'佔10—20%，#e/^<3"o々re7/^2"erar^i"ip力27/cwi1佔10—15%,#6^力<2/7057力<36/\3s/^oY切a//ae5—8%,yJ/"力a/70COCCi/sra"//e///佔2.5-5%。全文摘要本發明公開了一種厭氧降解纖維素產甲烷的複合菌，該複合菌由13株菌組成，這13株菌分屬兼性厭氧和嚴格厭氧的發酵性細菌、產氫產乙酸細菌和產甲烷菌，該複合菌不僅能高效厭氧降解纖維素，而且可以利用纖維素的降解產物產甲烷，可以廣泛應用於秸稈沼氣發酵、堆肥處理等轉化過程。文檔編號C12N1/20GK101475926SQ20091010308公開日2009年7月8日申請日期2009年1月19日優先權日2009年1月19日發明者代麗蓉,劉來雁,劉翔波,尹小波,輝張,強李,輝羅,宇鄧,馬詩淳,霞黎申請人:農業部沼氣科學研究所