一種毛細管電泳-化學發光法檢測非衍生胺基酸的方法及其檢測裝置的製作方法

2023-06-04 09:29:51 1

專利名稱：一種毛細管電泳-化學發光法檢測非衍生胺基酸的方法及其檢測裝置的製作方法
技術領域：
本發明屬於分析化學領域，特別涉及一種毛細管電泳-化學發光法檢測非衍生胺基酸的方法及其檢測裝置。
背景技術：
生物體內胺基酸的水平反映了生物體中的許多生命現象，並和許多疾病密切相關。因此，胺基酸的檢測在臨床診斷和臨床基礎研究中具有重要的意義。然而，由於這類化合物缺乏紫外吸收、螢光活性以及電化學活性，大多分析方法需要對這類化合物進行衍生，雖可以獲得較好的靈敏度，但是操作繁瑣，定量測定受衍生情況影響較大。化學發光(CL)法檢測具有靈敏度高，結構簡單，不需要任何外加光源等特點，近年來毛細管電泳檢測受到 人們的關注。目前，有以下幾種發光體系應用到胺基酸的檢測中(I)過氧化草酸鹽發光反應測定胺基酸螢光衍生物。這種方法雖可獲得較高的靈敏度，但是仍需要衍生，且操作複雜，條件苛刻。(2)魯米諾-次溴酸鹽發光體系，在鹼性條件下，胺基酸會抑制魯米諾-次溴酸鹽發光反應，以發光信號的衰減測定胺基酸的含量這種方法操作簡便，但靈敏度受限。這種方法操作簡便，但靈敏度受限。(3)魯米諾-過氧化氫發光體系，胺基酸可與銅離子形成絡合物，並催化化學發光活性。由於銅離子本身能有效催化發光反應，因此具有較高的發光背景，致使靈敏度不高。因此，發展ー種操作簡便、靈敏度高的發光體系用於測定非衍生胺基酸將是十分必要的。

發明內容
本發明要解決的技術問題就是針對現有的毛細管電泳-化學發光法檢測胺基酸的方法存在操作繁瑣、靈敏度低的缺陷，提供ー種操作簡單、靈敏度高的毛細管電泳-化學發光法檢測非衍生胺基酸的方法，及其檢測裝置。本發明的技術方案如下ー種毛細管電泳-化學發光法檢測非衍生胺基酸的方法，包括以下步驟(I)採用下述(i) (iii)中的任何ー種進行發光體系的混合(i)將納米氧化銅和魯米諾添加於毛細管電泳的流動相中，再將過氧化氫溶液在電泳毛細管柱的柱後通過化學發光檢測池的T型通道進行添加；(ii)先將魯米諾溶液添加於流動相中，然後將納米氧化銅和過氧化氫溶液在電泳毛細管柱的柱後分別通過化學發光檢測池的兩個T型通道進行添加；(iii)分別將納米氧化銅和魯米諾-過氧化氫混合液在電泳毛細管柱的柱後的化學發光檢測池的兩個T型通道進行添加；(2)走基線，在化學發光檢測池中測光信號，至系統穩定；然後(3)進胺基酸樣品，進行毛細管電泳分離和光信號輸出。其中為實現對非衍生胺基酸檢測，該流動體系中的發光體系各物質濃度如下納米氧化銅IXlO-4 lXl(T2mol/L，魯米諾1Χ1(Γ5 lXl(T3mol/L，過氧化氫1Χ1(Γ3 lXlO^mol/L。最佳為納米氧化銅I X lCT3mol/L,魯米諾5X lCT4mol/L,以及過氧化氫I X lO—imol/L。其中，納米氧化銅較佳的是採用低熱固相配位化學反應熱分解製備的納米氧化銅，粒徑< 10nm。本發明中，上述步驟(I)是本發明特別改良的，步驟(2)和(3)則是常規的毛細管電泳-化學發光法所用的方法。在納米氧化銅粒子粒徑均一，不影響實際樣本的分離的情況下，以第(i)種發光體系混合方式為優。不然以第(ii)種發光體系混合方式為好。上述檢測方法較佳的採用本發明提供的毛細管電泳-化學發光檢測裝置進行。該裝置的結構如圖I。其中，所用的部件都是常規部件，除了毛細管柱後化學發光檢測池是本發明特別設計的。
因此本發明的技術方案還包括ー種毛細管電泳-化學發光法檢測非衍生胺基酸的毛細管柱後化學發光檢測池，包括兩個T型發光試劑加樣通道，兩者距離為2 5cm，以2. 5cm為宜 ，第一 T型發光試劑加樣通道,距分離毛細管柱後Icm ;第二 T型發光試劑加樣通道與PMT檢測窗ロ的距離大於O. 5cm，2cm左右為宜。PMT檢測窗ロ O. 5 1cm，以Icm為宜。該兩個T型發光試劑加樣通道內徑為50 320 μ m，以100 μ m為宜。該毛細管柱後化學發光檢測池能夠用於上述第(i)至(iii)種發光體系混合方式，尤其適合用於第(ii)種發光體系混合方式。本發明的技術方案還包括一種毛細管電泳-化學發光法檢測非衍生胺基酸的裝置，包括高壓電源、電泳毛細管、毛細管柱後化學發光檢測池、光電倍增管(PMT)，其中所述的毛細管柱後化學發光檢測池即上文所述的本發明特別設計的毛細管柱後化學發光檢測池。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。本發明中，當非衍生胺基酸與納米氧化銅充分混合吋，由於納米氧化銅比表面積大，胺基酸能有效吸附於納米粒子表面，形成銅-胺基酸配合物，其能有效增強催化魯米諾-過氧化氫發光的能力。而且由於納米氧化銅比ニ價銅離子具有更低的發光背景，因而檢測靈敏度更高。為此，本發明以納米氧化銅催化魯米諾-過氧化氫發光，構建檢測非衍生胺基酸的毛細管電泳的發光檢測系統。本發明首次將納米氧化銅-魯米諾-過氧化氫作為發光體系用於毛細管電泳-化學發光檢測非衍生胺基酸。本發明的改良還在於化學發光體系的混合方式、組成配比及適合該檢測體系的毛細管柱後化學發光檢測池的設計。採用本發明所提供的檢測方法，可以用於生物樣品中胺基酸的檢測。


以下結合

本發明的特徵和有益效果。圖I顯示毛細管電泳-化學發光法檢測非衍生胺基酸的毛細管柱後化學發光檢測池的結構及其在毛細管電泳-化學發光檢測裝置中的位置和連接。圖2是實施例2中5種非衍生胺基酸混合物溶液的毛細管電泳圖(納米氧化銅-魯米諾-過氧化氫發光體系)。峰I 5分別為甘氨酸(Gly)、穀氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)和天冬醯胺(Asn)。
具體實施例方式以下通過具體實施例來進ー步說明本發明，但本發明並不受其限制。其中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例I製備納米氧化銅以I : I的摩爾比分別準確稱量草酸和一水合醋酸銅，充分研磨I小吋，50°C水浴加熱I小吋，固相產物在烘箱中70°C真空乾燥4小時，得前驅物CuC204。前驅物置於馬弗爐中加熱升溫至300°C，熱分解2小吋，獲得黑色的納米氧化銅粉末。 實施例2毛細管電泳-化學發光分離檢測甘氨酸(Gly)、穀氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)和天冬醯胺(Asn)五種胺基酸I、毛細管電泳-化學發光法檢測裝置參見圖I.本實施例採用MPI-B型多參數化學發光分析測試系統(西安瑞邁電子科技有限公司)，但其中的檢測池是採用本發明所設計的檢測池，檢測池內部結構及整個設備連接方式如圖I所示。2、溶液配製(I)胺基酸待檢樣品將五種胺基酸(甘氨酸、穀氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和天冬醯胺)混合溶於電泳運行緩衝液，形成樣品溶液，其中各胺基酸的濃度都是2. OX 105mol/L。(2) ImM納米氧化銅(pH 12):稱取一定量的納米氧化銅，加入電泳運行緩衝液超聲混勻後，調整溶液的PH值至12。使用前用O. I μ m的濾膜過濾即可。(3)0. IM過氧化氫(pH 12):用電泳運行緩衝液稀釋30%的過氧化氫至所需濃度，調節溶液的PH值至12。(4)電泳運行緩衝液30mmol/L硼砂-10mmol/L磷酸緩衝溶液,3%甲醇,0. 5mmol/L十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，O. 5mmol/L魯米諾，pH9. 5。3、操作步驟分離的熔融石英毛細管(75μηι i. d. X40cm)使用前依次用O. Imol/LNaOH、超純水和電泳運行緩衝液(電泳運行緩衝液見表I)各衝洗3分鐘。2次運行之間依次用超純水和緩衝液各衝洗3分鐘。進樣之前，ImM納米氧化銅(pH 12)以I μ 1/min流速從化學發光檢測池的第一 T型發光試劑加樣通道進行添加，而氧化劑O. IM過氧化氫(pH 12)以I μ I/min的流速從第二 T型發光試劑加樣通道進行添加。分離電壓設置為_20kV進行電泳30分鐘，待基線穩定後，進胺基酸樣品，採用電遷移進樣5kVX5s，即進樣電壓為5kV，進樣時間為5秒鐘。分離的溫度為25°C，分離電壓為-20kV。得到的電泳分離圖見圖2。實驗中，以S/N = 3計算檢測限，甘氨酸(Gly)、穀氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)和天冬酉先月安(Asn)五種胺基酸的檢測限分別為3. OX 10_7mol/L, 5. I X l(T7mol/L, 5. 3 X l(T7mol/L,2. OX 10_7mol/L和2. 7X 10_7mol/L。這說明其檢測靈敏度均高於ニ價銅離子催化時的檢出限(10 6mol/L)。表I.實施例2所用的條件和參數
權利要求
1.ー種毛細管電泳-化學發光法檢測非衍生胺基酸的方法，其特徵在於，包括以下步驟 (I)採用下述(i) (iii)中的任何ー種進行發光體系的混合 (1)將納米氧化銅和魯米諾添加於毛細管電泳的流動相中，再將過氧化氫溶液在電泳毛細管柱的柱後通過化學發光檢測池的T型通道進行添加； (ii)先將魯米諾溶液添加於流動相中，然後將納米氧化銅和過氧化氫溶液在電泳毛細管柱的柱後分別通過化學發光檢測池的兩個T型通道進行添加； (iii)分別將納米氧化銅和魯米諾-過氧化氫混合液在電泳毛細管柱的柱後的化學發光檢測池的兩個T型通道進行添加； (2)走基線，在化學發光檢測池中測光信號，至系統穩定；然後 (3)進胺基酸樣品，進行毛細管電泳分離和光信號輸出。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，該流動體系中的發光體系各物質濃度如下納米氧化銅I X 10_41 X 10_2mol/L，魯米諾I X 10_5 I X 10^3mol/L,過氧化氫I X 10_3 I X 10 ijnol/L。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，該流動體系中的發光體系各物質濃度如下納米氧化銅I X l(T3mol/L,魯米諾5 X l(T4mol/L,以及過氧化氫I X 10_1mol/Lo
4.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述的納米氧化銅是採用低熱固相配位化學反應熱分解製備的納米氧化銅，粒徑< 10nm。
5.一種毛細管電泳-化學發光法檢測非衍生胺基酸的毛細管柱後化學發光檢測池，其特徵在幹，包括兩個T型發光試劑加樣通道，兩者距離為2 5cm，以2. 5cm為宜；第一 T型發光試劑加樣通道，距分離毛細管柱後Icm ;第二 T型發光試劑加樣通道與PMT檢測窗ロ的距離大於0. 5cm, 2cm左右為宜。
6.如權利要求I所述的檢測池，其特徵在於，PMT檢測窗ロ0. 5 1cm，以Icm為宜。
7.如權利要求I所述的檢測池，其特徵在幹，該兩個T型發光試劑加樣通道內徑為50 320 iim，以 IOOiim 為宜。
8.ー種毛細管電泳-化學發光法檢測非衍生胺基酸的裝置，包括高壓電源、電泳毛細管、毛細管柱後化學發光檢測池、光電倍增管，其特徵在於，所述的毛細管柱後化學發光檢測池為權利要求5 7任一項所述的毛細管柱後化學發光檢測池。
全文摘要
本發明公開了一種毛細管電泳-化學發光法檢測非衍生胺基酸的方法及其檢測裝置。該方法包括(1)採用下述(i)～(iii)中的任何一種進行發光體系的混合(i)將納米氧化銅和魯米諾添加於毛細管電泳的流動相中，再將過氧化氫溶液通過化學發光檢測池的T型通道進行添加；(ii)先將魯米諾溶液添加於流動相中，然後將納米氧化銅和過氧化氫溶液分別通過化學發光檢測池的兩個T型通道進行添加；(iii)分別將納米氧化銅和魯米諾-過氧化氫混合液通過兩個T型通道進行添加；(2)走基線，至系統穩定；然後(3)進胺基酸樣品，進行毛細管電泳分離和光信號輸出。本檢測裝置的特徵在於檢測池。本方法操作簡單、靈敏度高，可以檢測非衍生胺基酸。
文檔編號G01N1/38GK102854182SQ20111017768
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月28日 優先權日2011年6月28日
發明者曹旭妮, 徐曉婧, 夏琨 申請人:華東理工大學