經pd-l1基因修飾的骨髓間充質幹細胞在移植排斥反應中的應用的製作方法

2023-05-28 10:40:51

專利名稱：經pd-l1基因修飾的骨髓間充質幹細胞在移植排斥反應中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種幹細胞在移植排斥反應中的應用，尤其涉及一種經ro-Li基因修飾的骨髓間充質幹細胞在移植排斥反應中的應用。
背景技術：
異體複合組織移植因可以提供良好的外形、功能修復，在大面積燒傷、嚴重畸形或組織缺如患者的治療中受到越來越多的青睞。然而，移植術後受者對移植物的排斥反應是移植成功的首要障礙。各種免疫抑制劑的應用雖可以預防移植物被機體排斥，但長期應用所帶來的機會性感染和惡性腫瘤的風險，以及不可避免的慢性排斥反應嚴重降低了患者的生存質量、阻礙了這一技術的臨床應用。隨著幹細胞工程和基因工程等技術手段的相關理 論、實踐的不斷完善，基因治療和細胞治療逐漸成為促進移植物成活的兩個重要手段。T細胞是參與異體移植排斥反應的關鍵效應細胞，阻斷共激活分子或活化共抑制分子而誘導T細胞無能，可以誘導外周免疫耐受，促進異體移植物成活，對於預防移植排斥反應具有很大的應用前景，有望成為解決移植排斥的新靶點。PD-Ll (Programmed deathfactor-Ligandl, F1D-Ll,程序性死亡因子配體I)是新近發現的具有免疫負調節作用的B7家族新成員，編碼290個胺基酸的跨膜蛋白，包含一個IgV樣區、一個IgC樣區、一個跨膜疏水區和一個30個胺基酸的胞內尾，胞內區有一個蛋白激酶C的磷酸化位點。其表達在多種組織，在中樞和外周免疫耐受、自身免疫性疾病、炎症反應調節中都起著重要作用。增強細胞表面ro-Li的表達，激活T細胞活化的共抑制信號從而抑制T細胞的活化是誘導外周免疫耐受的新思路。間充質幹細胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是一群具有自我更新能力和多向分化潛能的成體非造血多能幹細胞，最早從荷蘭豬的骨髓中發現(Bone Marrow StemCells, BMSCs)，此後發現其廣泛存在於體內各組織中。MSCs具有低免疫源性，可以在不同個體間進行移植並發揮生物學效應。其生物學功能豐富，不僅能多向分化、促進組織細胞再生，而且可以調節免疫狀態，減輕排斥反應的發生。BMSCs的這些特點使其成為理想的細胞及基因治療載體。但是，單獨應用BMSCs並不能維持移植物的長期存活，其應用於免疫源性更強的異體複合組織移植時並沒有取得明顯延長移植物存活時間的效果。免疫性疾病的實驗研究提示，BMSCs可以通過與免疫細胞間的接觸作用而抑制效應性T細胞的活化，發揮免疫抑制作用。因此，有望通過基因工程化間充質幹細胞增強目的基因的表達，提高其抑制排斥反應的生物學效能，誘導外周免疫耐受。慢病毒載體具有可感染分裂細胞及非分裂細胞、轉移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發宿主免疫反應等優點。pLV-puix)載體是基於HIVl的慢病毒基因過表達載體，包含了生產慢病毒所必須的病毒原件以及提高病毒滴度及基因表達效率的原件，可以同時表達外源插入基因片段和Puromycin抗性基因，方便地使用Puromycin篩選出穩定過表達目的基因的細胞。Gateway克隆技術具有操作簡單、省時高效、可以同時克隆一個或多個基因到任何蛋白表達系統等特點，已成功應用於很多基因表達載體的構建。基於此以及慢病毒載體在哺乳動物細胞上進行基因轉染和蛋白表達的高效性，使其在基因治療研究中受到青睞。

發明內容
為了解決背景技術中存在是上述技術問題，本發明提供了一種可調節免疫狀態、具有抑制移植排斥反應的功能、在異體器官移植的臨床應用中具有重要的指導意義、為誘導外周免疫耐受奠定了基礎以及具有廣闊的應用前景的經ro-Li基因修飾的骨髓間充質幹細胞在移植排斥反應中的應用。

本發明的技術解決方案是本發明提供了一種經ro-Li基因修飾的骨髓間充質幹細胞在移植排斥反應中的應用。經ro-Li基因修飾的骨髓間充質幹細胞在抑制移植排斥反應中的應用。經TO-Ll基因修飾的骨髓間充質幹細胞在製備抗移植排斥反應藥物中的應用。經TO-Ll基因修飾的骨髓間充質幹細胞在製備誘導外周免疫耐受藥物中的應用。上述經ro-Li基因修飾的骨髓間充質幹細胞是將ro-Li基因通過重組慢病毒體外轉染骨髓間充質幹細胞得到的。上述重組慢病毒是將ro-Ll基因的慢病毒表達載體轉染293FT細胞得到的。上述ro-Ll基因，是通過ro-Ll表達克隆在慢病毒基因過表達載體PLV-Puro後獲得的。上述F1D-Ll表達克隆是通過Gateway克隆系統獲得的。本發明的優點是I、本發明提供了經ro-Ll基因修飾的骨髓間充質幹細胞在抑制移植排斥反應、誘導外周免疫耐受中的應用。該充質幹細胞不僅保持了 BMSCs自身的免疫調節作用，同時又增加了 ro-Ll對τ細胞活化的抑制作用，賦予了該細胞更強的免疫調節作用，使其能夠與移植後的T細胞結合，從而減輕或延遲移植排斥反應的發生。2、本發明利用含目的基因ro-Ll的慢病毒轉染經體外培養的間充質幹細胞移植到接受異體肢體移植的大鼠體內，觀察對異體肢體存活情況的影響。體外研究發現ro-Ll基因轉染的BMSCs可以抑制T細胞的增殖及多種致炎因子的生成，體內應用後可以顯著延長肢體存活時間。3、為增加療效，本發明的藥物可以與其它免疫抑制劑聯合應用，減少免疫抑制劑引起的毒副作用。4、通過在本發明的基礎上，增加GFP等報告基因，以進行細胞移植後的細胞示蹤，進而探討其發揮作用的機制。5、本發明在異體器官移植的臨床應用中具有重要的指導意義，並為誘導間充質幹細胞介導的外周免疫耐受奠定了基礎，應用前景廣闊。


圖IA是經傳代培養的大鼠BMSCs圖；圖IB是第三代BMSCs進行表面抗原流式細胞術鑑定結果圖IC是第三代BMSCs進行誘導分化的結果圖；圖2A是大鼠I3D-Ll基因凝膠電泳結果圖；圖2B是大鼠I3D-Ll與GFP基因共轉染大鼠BMSCs後GFP表達的螢光顯微鏡觀察結果圖；圖2C是大鼠I3D-Ll與GFP基因共轉染大鼠BMSCs後細胞純度流式細胞術檢測結果圖；圖3A是單向混合淋巴細胞反應檢測轉基因BMSCs的體外免疫抑制功能鑑定結果
圖3B是大鼠異體肢體移植模型及各組大鼠生存率結果。
具體實施例方式本發明提供了經ro-Li基因修飾的骨髓間充質幹細胞在移植排斥反應中的應用。尤其是經ro-Ll基因修飾的骨髓間充質幹細胞在抑制移植排斥反應中的應用。尤其是經ro-Ll基因修飾的骨髓間充質幹細胞在製備抗移植排斥反應藥物中的應用。尤其是經ro-Ll基因修飾的骨髓間充質幹細胞在製備誘導外周免疫耐受藥物中的應用。本發明所採用的經ro-Ll基因修飾的骨髓間充質幹細胞是將ro-Ll基因通過重組慢病毒體外轉染骨髓間充質幹細胞得到的。本發明所採用的重組慢病毒是將ro-Ll基因的慢病毒表達載體轉染293FT細胞得到的。本發明所採用的ro-Ll基因，是通過ro-Ll表達克隆在慢病毒基因過表達載體pLV-Puro後獲得的。本發明所採用的ro-Ll表達克隆是通過Gateway克隆系統獲得的。以下結合具體實施對本發明做進一步詳細說明。本發明通過基因工程手段把大鼠ro-Ll過表達於骨髓間充質幹細胞。該ro-Ll的鹼基序列如下I atgaggatat ttgctgtcct tatagtcaca gcctgcagtc acgtgctagc ggcatttacc61 atcacagctc caaaggacct gtacgtggtg gagtatggca gcaatgtcac gatggaatgc121 agattcccag tagaacagaa attggacctg cttgccttag tggtgtactg ggaaaaggaa181 gacaaggaag ttattcagtt tgtggaggga gaggaggacc tgaagcctca acacagcagc241 ttcaggggga gagccttctt gccaaaggac cagcttttga aggggaacgc ggtgcttcag301 atcacagatg tcaagctgca ggacgcaggt gtctactgct gcatgatcag ctatggtgga361 gcggactaca agcgaatcac attgaaagtc aacgctccat accgcaaaat caaccaaaga421 atttccatgg atccagccac ttctgagcat gaactaatgt gccaggctga gggttaccca481 gaagccgaag tgatctggac aaacagtgac caccagtccc tgagtgggga aacaactgtc541 accacttccc agactgagga gaagcttctc aacgtgacca gcgttctgag ggtcaacgca601 acagctaatg atgttttcca ctgtacgttc tggagagtac actcagggga gaaccacacg661 gctgaactga tcatcccaga actgcctgta ccacgtctcc cacataacag gacacactgg
721 gtactcctgg gatccgtcct tttgttcctc atcgtggggt tcaccgtctt cttctgcttg781 agaaaacaag tgagaatgct agatgtggaa aaatgcggct tcgaagatag aaattcaaag841 aaccgaaatg atacacagtt cgaggagacg taa實施例I :骨髓間充質幹細胞的分離培養、鑑定(I) BMSCs 體外培養I. 1)4-6周健康lewis大鼠以1%戊巴比妥鈉麻醉過量處死，75%酒精浸泡lOmin。超淨工作檯內取出雙側股骨、脛骨和肱骨，去除附著肌肉及骨膜等組織，再次用1%呋喃西林溶液浸泡5min。I. 2) PBS液衝洗兩遍後，剪去骨的兩端，露出骨髓腔，Iml注射器抽取預冷PBS，自 骨端沿長軸刺入骨髓腔內，在培養皿中反覆衝洗骨髓腔，收集骨髓。I. 3)將所得骨髓懸液用彎頭吸管反覆輕輕吹打，使其分散為細胞懸液，200目濾網過濾去除沉渣，得單細胞懸液。將所得單細胞懸液移入IOml離心管，室溫、1000r/min，離心5min，棄去上清液，含10%FBS的DMEM培養液重懸並稀釋至IOml接種於75cm2的培養瓶中，置37°C、5%C02、飽和溼度的培養箱中培養。I. 4) 48h後首次換液，加入等量培養基，以後每72h換液一次，每次更換培養基時在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。待細胞長至90%融合時，用O. 25%的胰酶消化傳代，參見圖1A，是經傳代培養的大鼠BMSCs圖；I. 5)留取3-6代細胞凍存於液氮備用，圖IB是第三代BMSCs進行表面抗原流式細胞術鑑定結果圖；圖IC是第三代BMSCs進行誘導分化的結果圖。(2) BMSCs 鑑定2. I)流式細胞儀表面抗原鑑定取第3代細胞，調整濃度為IXlO6Ail/管，吹打使分散，分別加入螢光標記的抗體Anti-⑶31-FITC(檢測結果如圖2B所示，該圖是大鼠I3D-Ll與GFP基因共轉染大鼠BMSCs後GFP表達的螢光顯微鏡觀察結果圖)，Anti-⑶45-PE及Anti-CD29-PE，Anti-CD44_FITC，Anti-CD90_PerCP，Anti-CD105_PE，避光 4°C孵育 30min，PBS洗去未標記的抗體，1%多聚甲醛固定。上機檢測，分析樣本中細胞各表面標記的陽性率，其結果如圖2C所示，該圖是大鼠I3D-Ll與GFP基因共轉染大鼠BMSCs後細胞純度流式細胞術檢測結果圖。2. 2)誘導分化能力鑑定取第3代細胞以I X IO4/孔鋪於24孔板，以含10%FBS的DMEM培養液常規培養，待細胞達60%融合時，分別進行成骨和成脂培養，均設對照孔，每組6孔(成骨培養基組分為=DMEM培養基，10%FBS, O. I μ mol/L地塞米松，50 μ mol/L抗壞血酸，10mmol/L^-甘油磷酸鈉；成脂培養基組分為DMEM培養基，10%FBS, I μ mol/L地塞米松，200 μ mol/L吲哚美辛，0. 5mmol/L IBMX, 10 μ g/ml胰島素；對照培養基組分為DMEM培養基，10%FBS)。於37°C、5%C02、飽和溼度的培養箱中培養，隔日換液。成脂及成骨誘導及相應對照組分別於誘導2周、3周以油紅O染料、鹼性磷酸酶染液進行著色鑑定。實施例2 :骨髓間充質幹細胞體外基因轉染及轉染後表型鑑定。(I) PD-Ll基因片段的獲取取Noway-Brown大鼠下肢肌肉組織中I OOmg，應用RNA-Trizol提取RNA。通過Takara反轉錄試劑盒在500ng的mRNA中合成。獲取大鼠總cDNA。GeneBank中大鼠TO-Ll基因序列為NM001191954. 1，其電泳結果如圖2A所示，該圖是大鼠H) - LI基因凝膠電泳結果圖。
(2)構建慢病毒表達載體 pLVpuro/EFl a -PD_L1-IRES_GFP使用Gateway技術的四載體系統構建慢病毒表達載體pLVpuro/EFl a -PD-L1-IRES-GFP。計含att位點的引物，在上、下遊引物5 '端分別加上attBl、attB2、attB2r 和 attB3。pLVpuro/EFl a -PD_L1-IRES_GFP 表達克隆的構建和鑑定使用Invitrogen公司的LR重組反應酶，將入門克隆pUp-EFl a，pDown-PD-Ll和pTaiI-IRES-GFP與目的載體pDEST-puromycin重組，取2uL重組反應液轉化50uL Stbl3感受態細胞，氨苄西林LB培養板篩選陽性重組克隆並擴增，菌液行PCR擴增驗證，挑取構建正確的菌落培養過夜，提取質粒DNA，測序驗證。(3) pLVpuro/EF-1 a -PD-Ll-IRES-GFP 慢病毒包裝提前I天把293FT (5 X IO6個)細胞接種入IOcm培養皿內，包裝前2h，換入不含抗 生素的 293FT 培養液,在一無菌 5mL EP 管中，取 9ug ViraPower Lentiviral PackagingMix和3ug載體質粒加入到I. 5mL的Opti-MEM培養液中，輕輕搖勻，在另一無菌5mL EP管中，取36uL Lipofectamin 2000加入到Opti-MEM培養液混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，將混合物加入到培養皿中，37°C 5%C02培養。12-16h後換液，加入新鮮293FT細胞培養液。72h後收集含病毒的培養上清。4°C 3000r/min離心15min，去除細胞碎片，將病毒上清用0. 45um濾器過濾轉移入告訴離心管仲，4°C 7500g告訴離心90min。此時，病毒顆粒沉澱於離心管底部及側壁，去液體，用200UL1XPBS溶解，-80°C分裝儲存。(4) pLVpuro/EFl a -PD-Ll-IRES-GFP 轉染 BMSCs 取p3代傳代後3d狀態良好的細胞，用慢病毒pLVpuro/EFl a -PD_L1-IRES_GFP進行轉染。換液時加入ImL培養液於培養箱中預熱後,加入病毒懸液20uL和polybrene(6mg/L)，置於37°C、5%C02的培養箱中培養。12h後去除含病毒的培養液，換為L-DMEM培養液。第2天同樣時間，再再ImL培養液中加入20uL病毒懸液和polybrene, 12h後換液。連續感染3此後，用L-DMEM培養液繼續培養，提取細胞膜蛋白進行鑑定。(5)PD-Ll-IRES-GFP-BMSCs目的基因的表達和細胞功能測定以BMSCs為對照檢測ro-Ll-IRES-GFP-BMSCs目的基因的表達和細胞功能的變化，使用流式細胞儀檢測細胞表面ro-Ll和GFP及細胞周期。實施例3 =PD-Ll轉染骨髓間充質幹細胞誘導免疫耐受(I)體外實驗I3D-Ll轉染的BMSCs體外對T淋巴細胞活化增殖抑制試驗麻醉LEWIS和BN (Norway-Brown)大鼠，取出脾臟，製成單細胞懸液，用含10%FBS的RPMI1640培養基將細胞濃度調整至5 X 106/ml，將BN大鼠脾細胞作為反應細胞備用。以PHA處理去增殖後的LEWIS大鼠脾細胞作為刺激物，體外刺激BN大鼠T細胞增殖。以BMSCs、PD-Ll-MSCs為幹預措施，檢測其對淋巴細胞增殖的抑制作用。結果提示=PD-Ll-MSCs體外可以明顯抑制PHA刺激引起的淋巴細胞增殖反應。(2)體內實驗I3D-Ll轉染的BMSCs對肢體移植排斥反應的抑制作用A)大鼠異體後肢模型的建立供肢準備選BN大鼠為供體，1%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，電推子剔除腹部平面以下體表毛髮，75%酒精浸泡消毒5分鐘，手術臺上鋪無菌無折紗布，固定各肢體，截肢平面為大腿中段。從供體大鼠股內側開始切開皮膚及皮下脂肪組織，暴露骨神經、股動、靜脈和腹壁淺動、靜脈，結紮腹壁淺動、靜脈，於股神經內側與股血管束外側間隙作鈍性分離，游離髂外血管發出點至腹壁淺血管發出點之間的股動靜脈，保護股動、靜脈，結紮其向後側肌群及內側肌群各發出的一組分支。切斷股內側肌群、坐骨神經及其營養血管，然後切斷外側肌群及後側肌群，注意保護胭窩內的胭動靜脈及其在膝關節周圍的各分支，沿骨膜向近端剝離部分骨皮質。肝素利多卡因溫鹽水(IOOmlN. S+肝素鈉lml+2%利多卡因5ml)保護血管蒂，溼鹽水紗布保護供肢傷口待用。受體準備以LEWIS大鼠為受體，消毒備皮後，截肢平面定為大腿中段、結紮股動脈的腹壁淺血管分支、向內側肌群和後側肌群的分支，儘量游離股動靜脈至腹壁淺血管發出點以遠，驅走肢體內血液後，接扎動靜脈，以保留足夠長度的股動靜脈，保證血管回縮後吻合口無張力，切斷肌肉、骨骼截除受體肢體。術中切斷肌肉的平面低於供肢切取平面，便於與供肢肌肉進行縫合。肢體移植及術後護理將供肢內殘留血液以甘肅利多卡因溫鹽水徹底衝出至清亮。以Imm克氏鋼針固定髓腔，縫合肌肉，在萊卡手術顯微鏡下，以11-0號線端端吻合股靜脈及 股動脈。吻合完畢，觀察肢體血運供應，並給予估計失血量2. 5倍的N. S腹腔緩慢注射以擴容，30分鐘後若無血管危象，縫合皮膚，置於37°C電熱毯待甦醒。單籠餵養，自由進食。術後一周存活率為100%。術後9-12天肢體出現腫脹、水泡形成、脫毛、肢體皮膚變黑等排斥表現。經病理切片證實成功建立了大鼠肢體移植排斥模型。B) PD-Ll轉染的BMSCs經尾靜脈移植於受體肢體移植同時，用O. 125%胰蛋白酶消化I3D-Ll轉染的BMSCs，I X IO6個細胞重懸於ImL O. 9%生理鹽水中。待肢體移植完畢後，將其經尾靜脈緩慢注射於體內，作為實驗組(PD-LI-BMSCs組)。同時設BMSCs組及陰性對照組(ImL O. 9%生理鹽水)，其檢測結果如圖3A所示，該圖是單向混合淋巴細胞反應檢測轉基因BMSCs的體外免疫抑制功能鑑定結果圖。C)術後觀察及移植肢體存活情況的觀察術後大鼠甦醒好，肢體血運正常，術後均為發現血管栓塞等血管危象，大鼠精神、飲食、活動正常，無移植物抗宿主病表現。陰性對照組及BMSCs組受鼠術後I周后移植肢體逐漸出現腫脹、水泡形成、脫毛、肢體皮膚變黑、血運減少等排斥表現，於術後9-14天被完全排斥。PD-Ll-BMSCs組受鼠移植肢體排斥時間明顯推遲，術後18天後開始出現排斥反應，移植肢體於21-27天先後被完全排斥。經病理切片證實成功建立了大鼠肢體移植排斥模型。參見圖3B，大鼠異體肢體移植模型及各組大鼠生存率結果證實輸注本發明中PD-Ll基因修飾的BMSCs減輕受體對移植肢體的排斥反應，延長其存活，因而可以作為製備誘導移植肢體免疫耐受的新藥物。
權利要求
1.經ro-Li基因修飾的骨髓間充質幹細胞在移植排斥反應中的應用。
2.經ro-Li基因修飾的骨髓間充質幹細胞在抑制移植排斥反應中的應用。
3.經ro-Li基因修飾的骨髓間充質幹細胞在製備抗移植排斥反應藥物中的應用。
4.經ro-Li基因修飾的骨髓間充質幹細胞在製備誘導外周免疫耐受藥物中的應用。
5.根據權利要求I或2或3或4所述的經H)-L1基因修飾的骨髓間充質幹細胞在移植排斥反應中的應用，其特徵在於所述經ro-Li基因修飾的骨髓間充質幹細胞是將ro-Li基因通過重組慢病毒體外轉染骨髓間充質幹細胞得到的。
6.根據權利要求5所述的經ro-Ll基因修飾的骨髓間充質幹細胞在移植排斥反應中的應用，其特徵在於所述重組慢病毒是將ro-Ll基因的慢病毒表達載體轉染293FT細胞得到 的。
7.根據權利要求6所述的經H)-L1基因修飾的骨髓間充質幹細胞在移植排斥反應中的應用，其特徵在於所述ro-Li基因，是通過ro-Li表達克隆在慢病毒基因過表達載體pLV-Puro後獲得的。
8.根據權利要求7所述的經H)-L1基因修飾的骨髓間充質幹細胞在移植排斥反應中的應用，其特徵在於所述ro-Ll表達克隆是通過Gateway克隆系統獲得的。
全文摘要
本發明涉及一種經PD-L1基因修飾的骨髓間充質幹細胞在移植排斥反應中的應用。本發明可調節免疫狀態、具有抑制移植排斥反應的功能、在異體器官移植的臨床應用中具有重要的指導意義、為誘導外周免疫耐受奠定了基礎以及具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61K35/28GK102764272SQ20121025541
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月23日 優先權日2012年7月23日
發明者朱雄翔, 李娜, 李小強, 王耀軍, 王耘川, 胡大海, 胡曉龍, 董茂龍, 鄭朝, 韓軍濤 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學