依託泊苷誘導建立的宮頸癌多藥耐藥細胞株的製作方法

2023-05-27 21:25:01 2

專利名稱：依託泊苷誘導建立的宮頸癌多藥耐藥細胞株的製作方法
技術領域：
本發明屬腫瘤生物學領域，涉及一種人宮頸癌耐藥細胞株。具體涉及以人宮
頸癌SiHa為親代細胞，通過逐步增加化療藥物依託泊苷(VP16)作用濃度，建
立了宮頸癌多藥耐藥細胞株SiHa/VP16。
背景技術：
宮頸癌嚴重危害著女性健康，其發病率居女性惡性腫瘤第二位。全世界每年 的宮頸癌新發病例約50萬，而我國每年新發病人數約佔世界總發病人數的1/3。 化療是治療宮頸癌的重要手段，但化療中常見且難以解決的問題是多藥耐藥性 的產生，即腫瘤同時對多種結構和作用機制不同的化療藥物產生交叉耐藥的現 象，它是化療失敗的主要原因。因此研究腫瘤多藥耐藥機制以及防止或逆轉腫 瘤多藥耐藥的發生對於提高化療效果十分重要。近年來，腫瘤耐藥細胞株已成 為重要的工具，大量研究利用它來揭示腫瘤細胞的耐藥機制、研究腫瘤細胞的 耐藥性逆轉、開發及評價新的抗癌方法等。建立腫瘤耐藥細胞株具有重要應用 價值。植物鹼類化療藥物依託泊苷是腫瘤化療的常用藥物，作為二線藥物也被 用於宮頸癌的化療，建立宮頸癌對依託泊苷耐藥細胞株能夠為腫瘤耐藥相關研 究提供必要的研究模型。SiHa宮頸鱗癌細胞株，由日本YIto建立，是腫瘤研究 的常用工具。目前國內尚無SiHa細胞對VP16的耐藥株，國外有過相關研究， 但其耐藥株的建立方式、耐藥能力與我們的發明均有所不同。
腫瘤耐藥細胞株的建立通常有兩種方法， 一是逐步增加藥物濃度、持續誘導 法，二是大劑量衝擊間斷給藥法。國內外均有研究對這兩種方法進行了比較， 認為不同誘導方式可能獲得不同耐藥機理的耐藥細胞株，同時也可能影響腫瘤 細胞耐藥程度，持續誘導比衝擊誘導更易產生耐藥性。持續誘導法以腫瘤細胞 最終能在特定濃度化療藥物中穩定生長作為誘導成功的判定標準，細胞耐藥性 穩定、直觀，因此本發明主要採用該法來誘導耐藥細胞的產生。
腫瘤細胞耐藥程度的判定常用耐藥指數(resistant index, RI)來表示， RI是耐藥細胞半數抑制濃度(50% inhibitory concentration, IC50)與親代 細胞半數抑制濃度的比值。Snow等按耐藥指數的高低將耐藥性分為低度(〈5)、 中度(5-15)、高度(M5)。

發明內容
本發明的目的是建立宮頸癌耐藥細胞株SiHa/VP16，為以下相關研究提供耐 藥腫瘤細胞模型研究耐藥腫瘤細胞形態學及生物學特點、研究腫瘤多藥耐藥
機制、分析化療藥物敏感性及篩選化療藥物、開發腫瘤耐藥逆轉藥物、研發更 有效的腫瘤治療方法等。
本發明的耐藥細胞株建立步驟如下(1)人宮頸癌SiHa細胞株，復甦後用 DMEM培養液(含10%小牛血清、青黴素100U/ml、鏈黴素100ug/ml)於37。C、 5%C02、 95%溼度條件下培養；(2)取對數生長期SiHa細胞，換新鮮培養液，加 入VP16，使其作用濃度為0. lug/ml，在37。C、 5%C02、 95%溼度條件下繼續培 養，適時換液，維持0. lyg/ml藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、 傳代；(3)適當增加VP16的作用濃度，在37。C、 5%C02、 95%溼度條件下繼續培 養，適時換液，維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；(4) 重複步驟(3)直到獲得能在4n g/mlVP16中穩定生長、傳代及復甦的SiHa/VP16 細胞株。在誘導過程中，掌握適當的VP16增加濃度非常重要，理想狀況是既通 過增加藥物濃度篩選出少數耐藥細胞又不致於使全部細胞死亡，從而不斷獲得 有更高耐藥性的SiHa細胞。經過探索，在我們的發明中採用每階段增加0.5 2u g/mlVP16的方法，初始誘導階段細胞對藥物較敏感，每次增加的藥物量宜低，當細胞有一定 耐藥能力後可適當加大增藥濃度。歷時9個月建立了SiHa/VP16耐藥細胞株。用光學顯貨A 鏡觀察細胞形態、MTT法繪製細胞生長曲線、檢測細胞耐藥指數。我們發現， SiHa/VP16細胞立體感增強，有時呈現短且胖的梭形，但總地說來與SiHa細胞 差別不大；生長速度明顯減慢；對VP16明顯耐藥，耐藥指數(RI)為24.019， 除對VP16耐藥外，對MTX中度耐藥，對cDDP、 VCR、 5-Fu、 DOX呈低度耐藥。


圖1是倒置相差顯微鏡下SiHa活細胞觀察圖；圖2是倒置相差顯微鏡下
SiHa/VP16活細胞觀察圖；圖3是光學顯微鏡下SiHa細胞爬片HE染色觀察圖4是光學顯微鏡下SiHa/VP16細胞爬片HE染色觀察圖；圖5是SiHa及
SiHa/VP16細胞生長曲線。
具體實施例方式
實施例1
SiHa/VP16多藥耐藥細胞株按以下步驟建立(1)人宮頸癌SiHa細胞株，復甦後用DMEM培養液(含10%小牛血清、青黴素100U/ml、鏈黴素100ug/ml) 於37X:、 5%C02、 95%溼度條件下培養；(2)取對數生長期SiHa細胞，換新鮮培 養液，加入VP16，使其作用濃度為0. lug/ml，在37。C、 5%C02、 95%溼度條件 下繼續培養，適時換液，維持O. lug/ml藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩 定生長、傳代；(3)適當增加VP16的作用濃度，在37t、 5%C02、 95%溼度條件 下繼續培養，適時換液，維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳 代；(4)重複步驟(3)直到獲得能在2iig/mlVP16中穩定生長、傳代及復甦的 SiHa/VP16細胞株。每階段增加VP16量為0. 5 2ug/ml。歷時9個月建立 SiHa/VP16細胞株。
當細胞依次對0. 1 ti g/ml、 0.5tig/ml、 lpg/ml、 2ug/ml、 4ug/ml VP16 穩定耐藥後，及時凍存該濃度耐藥細胞於液氮中。凍存液由20%小牛血清、 5%DMS0、 75% DMEM培養液組成，凍存過程應逐步降溫，採取4°C30分鐘一-20 °C1小時一""7(TC過夜一液氮的順序進行。凍存細胞的復甦按以下程序進行在 一個25cm2的細胞培養瓶中加入至少10ml含10%小牛血清的培養液；從液氮中取 出裝有細胞的凍存管，立即放入37t:水浴輕輕搖動使凍存物在1分鐘內解凍， 用酒精棉球擦拭凍存管外壁後拿入超淨臺；將解凍後的細胞懸液移入已加了培 養液的培養瓶中，稍加搖動混勻，擰松瓶蓋，平放入二氧化碳培養箱中，在37°C、 5%C02、 95%溼度條件下培養，約24小時細胞貼壁後換新鮮培養液3 5ml繼續培 養。
實施例2
對本方法建立的SiHa/VP16細胞株進行形態學觀察及生物學特性鑑定 l.形態學觀察
(1) 倒置相差顯微鏡觀察活細胞形態
取對數生長期SiHa、 SiHa/VP16細胞各一瓶，換液後在倒置相差顯微鏡下 觀察活細胞形態並照像。可見SiHa/VP16細胞立體感增強，有時呈現短且胖的 梭形，但總地說來與SiHa細胞差別不大。(如圖l、 2所示)
(2) HE染色觀察細胞形態
取對數生長期SiHa、 SiHa/VP16細胞，用0. 25%胰酶消化製成單細胞懸液， 調整密度約1X107ml，接種於鋪蓋玻片的培養皿，放C02培養箱常規培養，待 細胞基本長成單層，取出蓋玻片，棄培養液，0.01M PBS浸洗3次，常規HE染
5色，於光學顯微鏡下觀察。可見SiHa/VP16與SiHa細胞無明顯差別。(如圖3、 4所示)。
2. 測定細胞生長曲線和群體倍增時間(MTT法)
取對數生長期SiHa、 SiHa/VP16細胞，用胰酶消化制單細胞懸液，調整細 胞密度。每種細胞均以2000/孔種於96孔板，設5個復孔。同時接種8塊96孔 板。於實驗的1 8天每天取出一塊板，用MTT法檢測595nm波長處0D值，通 過OD值一細胞數直線回歸方程將OD值換算成細胞數。將8次的實驗數據進行 分析，繪製生長曲線(如圖5所示)。按Patterson公式Td = A T X lg2/lg(Nt/No) 計算細胞倍增時間，Td為倍增時間，Nt為終末細胞數，No為初始細胞數(此 處用0D值代替)，A T為Nt No的時間，算得SiHa和SiHa/VP16細胞群體倍增 時間分別為38.04土2. 39h、 43.30士1.41h，耐藥細胞生長速度減慢(P<0.001)
3. 耐藥譜分析(MTT法)
取對數生長期的SiHa、 SiHa/VP16細胞，用0. 25%胰酶消化，制單細胞 懸液，以4X107ml的密度接種於96孔板，每孔180 u 1 (7200個細胞/孔)。 常規培養24h。每孔加20ixl用培養液配製的化療藥物，使八種藥物(依託泊 苷、順鉑、紫杉醇、長春新鹼、5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、多柔比星、絲裂黴素 C)分別以7 8個梯度濃度作用於細胞(梯度濃度根據預實驗所得，務必使半 數抑制濃度在此梯度範圍中間位置)。每一濃度設3復孔，同時設僅接種細胞的 無藥對照孔和僅加培養液的調零孔。於37°C、 5%C02、 95%溼度培養72h。每孔 加5mg/mlMTT液20iU，繼續培養4h。吸棄上清液，每孔加DMS0150 u 1，震蕩 儀震蕩10min，用酶標儀檢測595nm波長0D值，每三個復孔取其平均值。根據 0D值計算細胞抑制率，計算公式細胞抑制率=(1-實驗組0D值/對照組0D值) X100%。根據每種藥物不同濃度抑制率，利用SPSS15.0軟體Regression中的 Probit過程計算該藥半數抑制濃度(IC50)，從而計算每種藥物的耐藥指數RI， RP耐藥細胞IC50/親代細胞IC50，比較耐藥細胞和親代細胞的差異。分析表明， SiHa/VP16細胞對VP16的耐藥指數(RI)為24.019，屬高度耐藥，除對VP16耐 藥外，對MTX中度耐藥，對DDP、 VCR、 5-Fu、 D0X呈低度耐藥，對TAX、醒C無 耐藥性。詳細數據如表1所示。化療藥物IC50(SiHa) (li g/ml)IC50(SiHa/VP16) (w g/ml)RI
依託泊苷(VP16)6. 358152.71224.019
順鉬(cDDP)1. 8925.4322.871
紫杉醇(TAX)0.0110.0111.000
長春新鹼(VCR)0. 0230.0672. 913
5-氟尿嘧啶(5-Fu)1. 7168. 1234. 734
氨甲喋呤(MTX)0. 4943. 5957. 277
多柔比星(D0X)0.0670. 3234. 821
絲裂黴素c(羅c)0. 0890. 0830.933
表l
保藏該生物材料樣品的單位中國典型培養物保藏中心 地址湖北省武漢市武昌珞珈山
培養物名稱人宮頸癌多藥耐藥細胞株SiHa/VP16 保藏日期2009年1月20日 保藏編號CCTCC一C200904
權利要求
1. 一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，其特徵在於細胞株命名為SiHa/VP16，系利用化療藥物依託泊苷(VP16)誘導人宮頸癌SiHa細胞株建立，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC—C200904。
2. 根據權利要求1所述的一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，其特徵在於宮頸癌多藥 耐藥細胞株按以下步驟建立(1)人宮頸癌SiHa細胞株，復甦後用畫EM培養 液(含10%小牛血清、青黴素100U/ml、鏈黴素100ug/ml)於37。C、 50線、95% 溼度條件下培養；(2)取對數生長期SiHa細胞，換新鮮培養液，加入VP16，使 其作用濃度為0. 1 u g/ml，在37°C、 5%C02、 95%溼度條件下繼續培養，適時換液， 維持O.lUg/ml藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；(3)適當 增加VP16的作用濃度，在37'C、 5%C02、 95%溼度條件下繼續培養，適時換液， 維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；(4)重複步驟(3)直 到獲得能在4 " g/mlVP16中穩定生長、傳代及復甦的SiHa/VP16細胞株。
3. 根據權利要求1和2所述的一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，其特徵在於步驟(3) 每次增加的VP16濃度為0. 5 2 u g/ml。
4. 根據權利要求1和2所述的一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，其特徵在於該細胞 株對VP16的耐藥指數(RI)為24. 019，除對VP16耐藥外，對MTX、 cDDP、 VCR、 5-Fu、 DOX有交叉耐藥。
5. 權利要求1、 2、 3和4所述的一種宮頸癌多藥耐藥細胞株SiHa/VP16在腫瘤 研究中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，特徵是選擇人宮頸癌SiHa細胞株作為親代細胞，從0.1μg/ml逐步增加化療藥物依託泊苷(VP16)的作用濃度至4μg/ml，建立SiHa/VP16耐藥細胞株。SiHa/VP16細胞能在4μg/mlVP16中穩定生長、傳代及復甦，對VP16的耐藥指數(RI)為24.019，除對VP16耐藥外，對MTX、cDDP、VCR、5-Fu、DOX有交叉耐藥。本發明目的是為腫瘤相關研究提供耐藥腫瘤細胞模型。
文檔編號C12N5/08GK101503673SQ20091005826
公開日2009年8月12日 申請日期2009年2月2日 優先權日2009年2月2日
發明者劉珊玲, 和 王, 陳新蓮 申請人:四川大學華西第二醫院