一種生產豬α-幹擾素的純化方法
2023-05-28 11:18:16 1
專利名稱：一種生產豬α-幹擾素的純化方法
技術領域：
本發明屬於生物製劑領域，更具體地說，是涉及一種用於生產豬a-幹擾素的純化方法。
背景技術：
幹擾素(IFN)是一類具有廣泛生物學活性的蛋白質，具有調節機體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種作用，是機體防禦系統的重要組成部分。IFN的抗病毒活性是通過宿主細胞而間接完成的，並具有嚴格的種屬特異性及選擇性。根據其來源和結構，IFN可分為
a、P、Y三種類型，近年來，還發現了《、T等類型的幹擾素。IFN-a主要由單核細胞產生；IFN-P主要由纖維母細胞產生，血管內皮細胞也可產生；IFN-Y由抗原及PH等有絲分裂原刺激T細胞後產生，此外，NK細胞也可產生。IFN-T是反芻動物孕體附植時滋養層細胞分泌的特有的妊娠識別信號因子，在妊娠識別中發揮著重要的作用。 豬幹擾素是被研究最早的動物幹擾素之一，20世紀80年代就有豬幹擾素的相關報導。近年來，對豬幹擾素的誘導條件和理化活性有了進一步的研究，同時對豬白細胞幹擾素進行了大量的臨床試驗。研究表明，它對豬的許多病毒性傳染病，如流行性腹瀉、豬瘟、傳染性胃腸炎等，以及對牛病毒性腹瀉、小鵝瘟，羔羊腹瀉等都具有不錯的療效，試驗證實豬幹擾素與牛羊等動物之間存在交叉活性。最近幾年，豬幹擾素a、0、Y基因的分子克隆與序列分析獲得成功。目前，生產動物用的幹擾素(如豬幹擾素)的常見方法有生物來源提取法、基因重組技術法等。其中利用重組菌株表達生產幹擾素，具有無汙染、安全性高、純度高、生物活性高、成本低等優點，從而進入大規模的產業化生產階段，並廣泛應用於臨床。目前已成為當代生物技術領域中應用較為廣泛的細胞激活素。但是，利用重組菌株表達生產幹擾素，在後期的分離純化過程中一般都要使用價值昂貴的單抗柱，純度才能達到95 %以上；而目前國產的單抗柱，無論在產量和質量上，都不能滿足廠家的需要，而只能高價進口，增加生產成本。因此，目前需要一種經濟、快速、高效地的純化方法，以用於生產幹擾素。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中存在的不足，提供一種經濟、快速、高效的豬a-幹擾素純化方法。因此，本發明目的在於提供一種豬a -幹擾素純化方法，步驟包括(I)重組菌株進行發酵；(2)6000rpm, 15min離心發酵液取上清,通過微濾除雜、超濾濃縮；(3)用醋酸調節濃縮液的pH至5，並過陽離子層析柱(CM Sepharose柱層析)，收集0. 45mol/L的目標洗脫峰；(4)加入硫酸銨30% (W/V)至稍混池，6000rpm, 15min離心取上清；
(5)用凝膠過濾法先去熱原，用50mmol/L，pH5. 5的醋酸緩衝液平衡，上樣。過Sephacryl S-200層析柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫峰；(6)將充分浸泡後的S印hadex G_75凝膠裝入色譜柱中，用凝膠過濾法去熱原，用10mmol/L、pH7. 0的PBS緩衝液平衡，上樣。過S印hadex G-75色譜柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫液；置於4°C冰箱保存。本發明的有益效果是本發明提供的重組菌株表達幹擾素的後續純化方法，無需使用價格昂貴的單抗柱，避免了單抗脫落造成的汙染，縮短了純化時間，降低了生產成本，最終可得到純度高於97%的幹擾素原液，在工業生產中應用將會帶來良好的經濟效益。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的描述。實施例I :重組酵母表達豬a -幹擾素的純化(I)重組菌株進行發酵；(2)6000rpm, 15min離心發酵液取上清,通過微濾除雜、超濾濃縮；(3)用醋酸調節濃縮液的pH至5，並過陽離子層析柱(CM Sepharose柱層析)，收集0. 45mol/L的目標洗脫峰；(4)加入硫酸銨30% (W/V)至稍混池，6000rpm, 15min離心取上清；(5)先去熱原,用50mmol/L, pH5. 5的醋酸緩衝液平衡,過Sephacryl S-200層析柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫峰，其中通過凝膠過濾法進行去熱原；(6)將充分浸泡後的Sephadex G-75凝膠裝入色譜柱中，去熱原，用10mmol/L、pH7. 0的PBS緩衝液，過S印hadex G-75色譜柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫液，其中通過凝膠過濾法進行去熱原；置於4°C冰箱保存。實施例2 :豬a -幹擾素的活性測試取實施例一方法製備的樣品3批，進行檢測(I)生物活性檢測採用半數細胞抑制病變法，應用VSV-MDBK系統。參照《中華人民共和國藥典》2010年版。(2) SDS-PAGE測產品的純度分離膠15%，濃縮膠5%，上樣量IOy g，考馬斯亮藍250染色。(3) HPLC分析產物純度採用C18柱，柱長250mmX4. 6mm,以0-70%乙腈-0. 1%TFA做線性梯度洗脫。實驗結果如下表I :表I
權利要求
1.一種生產豬a-幹擾素的純化方法，步驟包括 (1)重組菌株進行發酵； (2)6000rpm,15min離心發酵液取上清,通過微濾除雜、超濾濃縮；(3)用醋酸調節濃縮液pH至5，並過陽離子層析柱(CMS印harose柱層析)，收集0.45mol/L的目標洗脫峰； (4)加入硫酸銨30%(W/V)至稍混池，6000rpm, IOmin離心取上清； (5)過S^hacrylS-200層析柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫峰；(6)過S印hadexG_75色譜柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫液，置於4°C保存。
2.如權利要求I所述的一種生產豬a-幹擾素的純化方法，其特徵在於所述的步驟(5)在實施之前，先去熱原，用50mmol/L，pH5.5的醋酸緩衝液平衡，上樣。
3.如權利要求2所述的一種生產豬a-幹擾素的純化方法，其特徵在於去熱原的方法為凝膠過濾法。
4.如權利要求I所述的一種生產豬a-幹擾素的純化方法，其特徵在於所述的步驟(6)在實施之前,將充分浸泡後的SephadexG-75凝膠裝入色譜柱中，去熱原,用10mmol/L、pH7. 0的PBS緩衝液平衡，上樣。
5.如權利要求4所述的一種生產豬a-幹擾素的純化方法，其特徵在於去熱原的方法為凝膠過濾法。
6.如權利要求I所述的一種生產豬a-幹擾素的純化方法，其特徵在於所述的重組菌株為畢赤酵母工程菌。
全文摘要
本發明涉及一種生產豬α-幹擾素的純化方法，包括發酵、粗提發酵液、陽離子層析柱純化、硫酸銨純化、Sephacryl S-200層析柱純化、Sephadex G-75色譜柱純化等步驟，其中在層析之前先去熱原。本發明方法無需單克隆抗體層析柱，能經濟、快速、高效地的純化獲得純度高於97％的α-幹擾素，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12P21/02GK102732587SQ20111008233
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月1日 優先權日2011年4月1日
發明者劉桂蘭, 王偉穎, 閆亮亮 申請人:瑞普(天津)生物藥業有限公司