一種人類胃疾病及動物模型組織晶片的製作方法

2023-05-28 14:46:46

專利名稱：：一種人類胃疾病及動物模型組織晶片的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，更具體地，涉及在片基上固定有組織心片。二、
背景技術：
隨著組織學、病理學的發展，人們對人體或其他動植物的認識，從解剖學上的器官水平向組織、細胞水平發展。但由於完整的器官很難用顯微鏡觀察，因此需要把器官切成很薄的切片進行染色觀察，為了解決這個問題，出現了組織學技術。該方法的原理是通過把器官切成小塊組織，用福馬林固定後，利用酒精脫去該組織中的水分，再浸入二甲苯或苯溶液脫去酒精，最後組織塊浸入熔化石蠟溶液中脫去二甲苯，放入模具內用石蠟溶液進行包埋，冷卻後形成石蠟塊。該石蠟塊利用切片機進行切片，把蠟片裱於玻璃片上，再進行烤片、脫蠟，染色、封片後就可以用顯微鏡進行觀察研究。目前，組織學技術不僅是單純染色顯微鏡觀察，還出現了各種特殊染色、免疫組織化學技術、原位雜交技術、原位PCR技術。近年來隨著基因組學、蛋白組學研究發展，人們研究的生理和疾病已逐步從分子水平向細胞水平及組織水平發展，因此，如何利用組織開展研究，是目前研究中所要解決問題之一。採用傳統組織技術的研究方法，由於組織標本需要量大，實驗工作量大，難以適應研究的學要。近年來，出現了組織微陣列晶片技術，解決了上述問題。該技術將數十個、數百個乃至上千個小的組織片整齊地排列在某一載體上(通常是載玻片)而製作成微縮組織切片，其基本操作程序(如圖1所示)包括設計並擬定組織晶片的分類系列、核對組織或有關疾病的病理診斷、組織定位、陣列蠟塊的製作、再從源蠟塊上鑽取組織並轉移到空白石蠟塊的相應位置、組織晶片切片。組織晶片的特點有體積小、信息含量大、高通量;減少或避免了對原始組織蠟塊的破壞；組織樣本的定位準確，減少無效組織;批量製作及可能的結果分析自動化；不同來源的病例的處理、染色和分析條件相同。胃部疾病是一組常見、多發行的疾病。胃癌的起因目前雖然還不明確，但是大致與以下幾種因素有關1、.慢性胃炎慢性胃炎，特別是慢性萎縮性胃炎與胃癌的發生關係密切，因為慢性萎縮性胃炎常合併有腸腺化生形成息肉，更增加了惡變的可能性，因此，常常把萎縮性胃炎作為癌前病變來看待。2、幽門螺旋桿菌感染我們以往通常把胃潰瘍的成因歸結為神經內分泌等因素。現在已經證實，胃潰瘍是由幽門螺旋桿菌引起的。對胃潰瘍病人進行系統的正規治療，對預防胃癌的發生有非常積極的意義。3.胃息肉胃息肉屬於胃的良性腫瘤，胃息肉中的上皮增生性腺瘤極易惡變成癌，被認為是癌前病變。如發現這種疾病，應該積極治療以消除隱患。4.吸菸及飲酒吸菸及長期飲酒，特別是酗酒者一般都有慢性胃炎，而正是慢性胃炎可能發生間變，甚至惡變成胃癌，所以說遠離菸酒也是預防胃癌的一個重要環節。5.飲食因素6.遺傳因素胃癌有很明顯的家庭傾向性。早期胃癌可分為以下各型(1990年WHO分類)①腺癌包括乳頭狀腺癌、管狀腺癌、與粘液腺癌(惡性度高於前兩者)，再根據分化程度又分為高分化、中分化與低分化3種；②未分化癌(惡性度最高)；③粘液細胞癌(即印戒細胞癌)；④特殊類型癌包括腺鱗癌、鱗癌、類癌、絨癌、癌肉瘤和神經內分泌癌等。還有一些罕見的癌肝癌樣胃癌、壁細胞癌、髓樣癌等。各種疾病存在一個動態發展的變化原位癌(原發癌限於黏膜層未累及黏膜固有層)；腫瘤侵及黏膜下層；腫瘤侵及肌層；腫瘤侵及漿膜層；侵及鄰近器官；胃鏡活檢證實為癌，但切除標本組織學檢查未發現癌；腫瘤浸潤深度無法判定；無區域淋巴結轉移；淋巴結轉移局限於腫瘤邊緣3cm以內的胃周淋巴結；淋巴結轉移超出腫瘤邊緣3cm以外，包括胃左動脈、肝總動脈、脾及腹腔周圍淋巴結；淋巴結轉移情況無法確定；無遠處轉移等。1994年世界衛生組織屬下的國際腫瘤研究機構將幽門螺桿菌列為引起胃癌的第I類(肯定)致癌原。幽門螺桿菌如何引發腫瘤的發生發展是目前研究的難點和熱點。尋找一種有效可靠的研究工具，從分子、細胞、組織水平上觀察這些疾病的發生、發展的整個過程從而找到有意義的基因和表達的蛋白質，是目前急需解決的問題。三、
發明內容本發明的目的是提供一種高效、簡便和低成本的人與感染幽門螺旋桿菌胃癌易感基因的動物的胃組織混合微陣列晶片，從而可以在分子、細胞、組織水平上研究胃癌疾病與幽門螺桿菌在人體以及動物體內的發生、發展的整個過程。通過該晶片亦可篩選出特異性、有意義的基因和及其表達的蛋白質作為診斷和治療的潛在用途。該胃組織微陣列晶片，包括片基、片基上連接有特異性組織點。片基可以是玻璃、生物膜、矽晶片、聚二氟乙烯膜或硝酸纖維膜，片基可以是經過防脫片處理的。片基上組織點所需不同大小直徑可為0.6mm，l.Omm，1.5mm，2.0mm，2.5mm，3.0mm，3.5mm，4.0mm，4.5mm，5.0mm，5.5mm,6.0mm等。密度為500個點/平方釐米1個點/平方釐米，每張片基上可有1000點10點不等。可以矩陣列方式、圓形方式或其他形狀排列。所述組織點至少選自以下正常或疾病病變的人體胃組織和動物模型胃組織人體胃組織(包括胃底、胃體、胃小彎、胃大彎、幽門、賁門)正常組織，慢性淺表性胃炎，單純型萎縮性胃炎，胃潰瘍，腸化型萎縮性胃炎完全性結腸化生，腸化型萎縮性胃炎不完全性結腸化生，腸化型萎縮性胃炎完全性小腸化生，腸化型萎縮性胃炎不完全性小腸化生，胃不典型增生，胃管狀腺瘤，胃絨毛狀腺瘤，胃管狀絨毛狀腺瘤，ZoHinge廣Ehison症候群，胃脈管瘤，胃平滑肌瘤，胃平滑肌肉瘤，胃神經鞘瘤，胃惡性神經鞘瘤，胃乳頭狀腺癌，胃管狀腺癌，胃粘液腺癌，胃印戒細胞癌，胃腺鱗癌，胃鱗癌，胃小細胞癌，胃未分化癌，胃惡性淋巴瘤等；動物模型的正常以及病變的胃組織首先建立幽門螺桿菌感染動物胃模型。通過給研究動物如蒙古沙鼠餵食含有幽門螺桿菌株的飼料而發生感染，在1周，2周或3周等不同的時間段宰殺動物獲取胃組織，研究動物在經過一系列的環境因素誘導引起胃組織發生病變的整個過程，最終導致胃癌發生。選取的組織包括:胃(包括胃底、胃體、胃小彎、胃大彎、幽門、賁門)正常組織，炎症組織，癌前病變組織及癌變組織。下面結合實施例具體闡述本
發明內容一、人與動物胃癌發病機理及發展全過程組織晶片人與動物胃癌發病機理及發展全過程組織晶片陣列中每個點的組織類型信息如表格一所示，排列後形成的組織晶片效果圖如圖2所示1為經過防脫片處理的在玻片，2為碳芯標記點(標記陣列讀取順序)，3為排列的組織樣本。點的直徑為l.Omm，點之間的間距為0.4mm。每行10個點，共12行。下面結合表格一詳敘陣列中排列點的組織類型在晶片左上角有一個碳芯標記點(Maker)用於給陣列的排列方向進行定位。Al、A2、為感染ATCC菌株3周的雄性蒙古沙鼠胃組織；A3、A4、為感染ATCC菌株3周的雌性蒙古沙鼠胃組織；A5、A6、A7、A8、為感染ATCC菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃組織A9、A10為對照組未感染菌且飼養8周的蒙古沙鼠胃組織。Bl、B2、B3、B4為感染感染ATCC菌株3周的雄性蒙古沙鼠胃組織；A3、A4、為感染ATCC菌株3周的雌性蒙古沙鼠胃組織；A5、A6、A7、A8、為感染ATCC菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃組織C5、C6、為對照組未感染菌且飼養20周的蒙古沙鼠胃組織；C7、C8、C9、C10為感染HP161菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃組織。Dl、D2、為感染HP161菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃組織；D3、D4、為對照組未感染菌且詞養8周的蒙古沙鼠胃組織；D5、D6、D7、D8、為感染HP161菌株8周的雌性蒙古沙鼠胃組織；D9、D10為對照組未感染菌且飼養8周的蒙古沙鼠胃組織。El、E2、為感染HP161菌株20周的雄性蒙古沙鼠胃組織；E3、E4、為對照組未感染菌且飼養20周的蒙古沙鼠胃組織；E5、E6、E7、E8、為感染HP161菌株20周的雌性蒙古沙鼠胃組織；E9、E10為未對照組未感染菌且詞養20周的蒙古沙鼠胃組織。Fl、F2、F3、F4，分別為胃(賁門)，胃(大彎)，胃(小彎)，胃(竇)正常組織；F5，F6，F7分別為慢性淺表性胃炎發展過程中輕度，中度，重讀三個階段的病變組織；F8、F9、F10分別為單純型萎縮性胃炎發展過程中輕度，中度，重度三個階段的病變組織；Gl為胃潰瘍病變組織；G2，G3，G4，G5分別為腸化型萎縮性胃炎不同病因完全性結腸化生，不完全性結腸化生，完全性小腸化生，不完全性小腸化生四種病變組織；G6、G7、G8分別為胃不典型增生三個不同發展階段輕度，中度，重度的病變組織；G9、GIO、Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7分別為胃管狀腺瘤，胃絨毛狀腺瘤，胃管狀絨毛狀腺瘤，ZoHinge「Ehison症候群，胃脈管瘤，胃平滑肌瘤，胃平滑肌肉瘤，胃神經鞘瘤，胃惡性神經鞘瘤癌變組織；H8、H9、HIO、II分別為兩例患有胃乳頭狀腺癌患者的腫瘤組織和腫瘤旁組織；12、B、14、15分別為兩例患有胃管狀腺癌患者的腫瘤組織和腫瘤旁組織；16、17、18、19分別為兩例患有胃粘液腺癌患者的腫瘤組織和腫瘤旁組織；110、Jl、J2、J3分別為兩例患有胃印戒細胞癌患者的腫瘤組織和腫瘤旁組織；J4、J5、J6、J7分別為兩例患有胃腺鱗癌患者的腫瘤組織和腫瘤旁組織；J8、J9、JIO、Kl分別為兩例患有胃鱗癌患者的腫瘤組織和腫瘤旁組織；K2、K3、K4、K5分別為兩例患有胃小細胞癌患者的腫瘤組織和腫瘤旁組織；K6、K7、K8、K9分別為兩例患有胃未分化癌患者的腫瘤組織和腫瘤旁組織；KIO、Ll、L2、L3分別為兩例患有胃惡性淋巴瘤患者的腫瘤組織和腫瘤旁組織；L4為一個碳芯標記點(Marker)用於標記陣列排列的結束位置。這一張含有反映人與動物胃癌不同發病機理及發展全過程的正常及癌變對照組織的晶片用於免疫組化，原位雜交，免疫螢光等不同試驗研究。tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11圖1為組織晶片製作基本流程。圖2為組織晶片示意圖其中1為經過防脫片處理的在玻片；2為碳芯標記點(標記陣列讀取順序)；3為排列的組織樣本。應理解，本說明書之題目及本說明書所述及之實施例僅用於說明本發明而不用於對本發明的範圍進行限制。權利要求1.一種組織微陣列晶片，包括片基和組織點，組織點以點陣方式排列並附於片基之上，其特徵在於所述組織點由正常人類正常胃組織、人類胃疾病病變部組織、蒙古沙鼠正常胃部組織、感染幽門螺杆的蒙古沙鼠胃部組織構成。2、根據權利要求1所述的一種組織微陣列晶片，其特徵在於所述片基可以是玻璃、膠片、生物膜、矽晶片、聚二氟乙烯膜或硝酸纖維膜。3、根據權利要求2所述的一種組織微陣列晶片，其特徵在於所述片基可以是經過防脫片處理。4、根據權利要求1所述的一種組織微陣列晶片，其特徵在於，所述組織點直徑為0.6毫米，1.0毫米，1.5毫米，2.0毫米，2.5毫米，3.0毫米，3.5毫米，4.0毫米，4.5毫米，5.0毫米，5.5毫米，6.0毫米。5、根據權利要求1所述的一種組織微陣列晶片，其特徵在於所述點陣方式可以為矩陣列方式或園形方式排列，密度為500至1個點/平方釐米，數量為1000點至10點。6、根據權利要求1所述的一種組織微陣列晶片，其特徵在於所述及的人類正常胃組織至少包括人類胃賁門、胃小彎、胃大彎、胃竇部組織。7、根據權利要求1所述的一種組織微陣列晶片，其特徵在於所述及的胃疾病至少包括慢性淺表性胃炎、單純性胃炎、萎縮性胃炎、胃潰瘍、胃不典型增生、胃管狀腺瘤、胃絨毛狀腺瘤、胃管狀絨毛狀腺瘤、ZoHinger^Ehison症候群、胃脈管瘤、胃平滑肌瘤、胃平滑肌肉瘤、胃神經鞘瘤、胃惡性神經鞘瘤、胃乳頭狀腺癌、胃管狀腺癌、胃粘液腺癌，胃印戒細胞癌，胃腺鱗癌，胃鱗癌，胃小細胞癌，胃未分化癌和胃惡性淋巴瘤。8、根據權利要求1所述的一種組織微陣列晶片，其特徵在於所述及的感染幽門螺杆蒙古沙鼠的胃部組織包括感染ATCC菌株的蒙古沙鼠胃部組織和感染HP161菌株的蒙古沙鼠胃部組織。9根據權利要求8所述的一種組織微陣列晶片，其特徵在於所述及的感染ATCC菌株蒙古沙鼠胃部組織包括感染ATCC菌株3周的雄性蒙古沙鼠胃組織、感染ATCC菌株3周的雌性蒙古沙鼠胃組織、感染ATCC菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃組織。10、根據權利要求8所述的一種組織微陣列晶片，其特徵在於所述感染HP161菌株蒙古沙鼠胃部組織包括感染HP161菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃組織、感染HP161菌株8周的雄性蒙古沙鼠胃組織、感染HP161菌株8周的雌性蒙古沙鼠胃組織、感染HP161菌株20周的雄性蒙古沙鼠胃組織、、感染HP161菌株20周的雌性蒙古沙鼠胃組織。全文摘要本發明公開了一種組織微陣列晶片，該晶片上組織點由人和動物正常胃組織、感染幽門螺桿菌的胃組織和胃疾病病變部組織構成，從而可以在分子、細胞、組織水平上研究胃疾病的發生、發展的整個過程與幽門螺桿菌感染之間的關係。該晶片亦可篩選出特異性、有意義的基因和及其表達的蛋白質。文檔編號G01N33/48GK101275941SQ20071003847公開日2008年10月1日申請日期2007年3月26日優先權日2007年3月26日發明者瓊周,蕭樹東,郜恆駿申請人:上海芯超生物科技有限公司