一種破壞煙麴黴生物膜的方法
2023-05-28 00:01:36 2
一種破壞煙麴黴生物膜的方法
【專利摘要】本發明提供一種破壞煙麴黴生物膜的方法，包括製備藥物、收集菌株、製備載體、製備孢子懸液、藥物敏感試驗、製備煙麴黴生物膜載體、藥物對煙麴黴生物膜作用和結晶紫半定量，本發明利用金銀花提取物的綠原酸破壞煙麴黴生物膜，用亞抑菌濃度的綠原酸破壞早期和成熟期的煙麴黴生物膜，本發明的亞抑菌濃度的綠原酸對早期及成熟期煙麴黴生物膜均具有破壞作用，破壞效果呈現出濃度依賴性。
【專利說明】一種破壞煙麴黴生物膜的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，涉及煙麴黴生物膜，具體涉及一種破壞煙麴黴生物膜的方法。
【背景技術】
[0002]生物膜是一種附著在組織的表面、由自身產生的胞外基質包圍的有結構的菌細胞群體，是相對於游離狀態的菌細胞而言的另一種微生物的生存方式。近年來研究發現，煙麴黴能在體內外形成生物膜，由於其菌絲被胞外基質所包裹，因此得以逃避抗真菌藥和機體免疫的傷害，從而能形成持續的感染源造成慢性而且耐藥的感染。由煙麴黴導致的侵襲性麴黴病是免疫低下患者主要的死亡原因之一，死亡率達到30-100%，目前治療侵襲性麴黴病的常用抗真菌藥物對煙麴黴生物膜效果欠佳，主要由於其胞外基質對煙麴黴菌絲細胞的保護，使得這些抗真菌藥的敏感性下降，研究報導顯示，生物膜中的煙麴黴菌比浮遊菌耐藥性高几十至上千倍，並且生物膜越成熟，胞外基質越緻密，煙麴黴生物膜就會越耐藥。如果能夠破壞生物膜，使胞外基質減少甚至完全清除，使生物膜內的菌細胞失去胞外基質的保護而變成游離狀態的菌細胞，那麼這些菌的耐藥性將會減低，目前尚未發現能破壞煙麴黴生物膜的藥物，因此治療煙麴黴生物膜相關感染成為臨床難題。
【發明內容】
[0003]本發明提供一種破壞煙麴黴生物膜的方法，包括製備藥物、收集菌株、製備載體、製備孢子懸液、藥物敏感試驗、製備煙麴黴生物膜載體、藥物對煙麴黴生物膜作用和結晶紫半定量，其特徵在於，用金銀花提取物的綠原酸破壞煙麴黴生物膜，具體步驟如下:
1)製備藥物取400~500mg綠原酸用3~6ml100%的二甲亞碸溶解，配製成濃度為102400 μ g/ml 的溶液，於-20°C ~_25°C儲存；
2)收集菌株收集煙麴黴菌株，質控菌株為ATCC22019近平滑念珠菌；
3)製備載體將直徑為1(T15mm玻璃細胞爬片進行高溫高壓滅菌，作為載體；
4)製備孢子懸液將步驟2)收集的菌株接種到PDA培養皿，置於35~37°C生化培養箱進行復甦，後轉至另一個PDA培養皿並置於35~37°C生化培養箱活化:1-5天後，用5~10ml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩衝液衝洗平皿表面收集孢子，用2(T30ml MOPS緩衝的RPM1-1640重懸孢子，用血細胞計數板調整孢子濃度，並用RPM1-1640液體培養液調整濃度為f 3X IO6.孢子?π1，再用RPM1-1640液體培養基稀釋50倍，得到2倍終濃度的孢子懸液；
5)藥物敏感試驗微量液基稀釋法，在無菌的96孔細胞培養板的第I至第10孔加入步驟4)製備的孢子懸液，再將步驟I)製備的綠原酸置於無菌的96孔細胞培養板的第I至第10孔，第I孔加入量為100 μ 1，第2~10孔依次倍比稀釋至二倍終濃度，第11孔為步驟4)製備孢子懸液的生長對照孔，第12孔為MOPS緩衝的RPM1-1640液體培養基，靜置於35~37°C培養48h，獲得綠原酸的最低抑菌濃度MIC ;最低抑菌濃度(MIC)的判定:肉眼觀察判斷終點，96培養板各個孔充分混勻之後與生長對照孔比較，100%生長抑制所對應的最低藥物濃度為此藥物的MIC;
6)製備煙麴黴生物I吳載體
A:早期模型建立將步驟2)收集的菌株接種到PDA培養皿，置於35~37°C培養箱培養活化3飛天，用5~IOml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩衝液衝洗平皿表面收集孢子，用2(T25ml MOPS緩衝的RPM1-1640重懸孢子，用血細胞計數板調整孢子濃度，並用RPM1-1640液體培養液調整濃度為1~5X IO5.孢子.Hir1Jf f 2ml孢子懸液放在步驟3)製備的載體上，靜置於35~37°C生化培養箱中培養；培養24h時載體上為早期煙麴黴生物膜；
B:成熟期模型建立將步驟A製備的煙麴黴生物膜培養48h時載體上為成熟期煙麴黴生物膜；
7)藥物對煙麴黴生物膜作用將步驟6)製備的兩種模型煙麴黴生物膜載體用無菌磷酸鹽緩衝液漂洗，後放入新的無菌載體中，按步驟5)獲得的綠原酸最低抑菌濃度MIC，加入亞抑菌濃度的綠原酸，每個孔加入量為1ml，空白組為MOPS緩衝的RPM1-1640液體培養基，靜置於35~37°C培養48飛0h，後取出載體，進行結晶紫半定量；
8)結晶紫半定量吸取步驟7)載體表面浮遊菌液，室溫乾燥，取f2ml1%結晶紫染色2(T30min，用磷酸鹽緩衝液洗脫未結合的結晶紫，室溫乾燥，用f2ml 95%乙醇脫水3飛min，取100-110 μ I洗脫液於96孔酶標板中，在波長為570nm處測各孔酶標值。
[0004]掃描電鏡觀察從24孔板中取出載體後按下面步驟操作:(1)2.5%戊二醛固定2小時；(2) 50%、60%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水，每個濃度脫水10分鐘；(3)臨界乾燥儀乾燥；(4)真空噴鍍金粉；(5)觀察和攝片，條件:電壓20kV，放大倍數2000倍。
[0005]以上所述步驟7)藥物對煙麴黴生物膜作用，靜置培養48_50h過程中，間隔24h用與原孔中相同的藥物換液。
[0006]以上所述亞抑菌濃度的綠原酸濃度為128yg/mfl024yg/ml，所述綠原酸為400^450mgo
[0007]以上所述步驟5)加入藥物的量為100 μ 1，靜置於35~36°C培養。
[0008]本發明突出的實質性進步和顯著的特點是: 本發明建立了早期和成熟期的煙麴黴生物膜，再以亞抑菌濃度的綠原酸作用，通過結晶紫半定量及掃描電鏡可以看出，綠原酸可以破壞早期和成熟期的煙麴黴生物膜，使生物膜中的胞外基質減少，並且綠原酸的濃度越大效果越明顯。由於本發明使用的綠原酸菌是亞抑菌濃度，該濃度的綠原酸對生物膜中的菌細胞並無殺傷作用，但是能夠破壞煙麴黴生物膜中已經形成的胞外基質，使生物膜中的菌細胞失去胞外基質的保護而變成浮遊菌，從而讓煙麴黴的耐藥性降低。
[0009]綠原酸能破壞煙麴黴生物膜，使生物膜狀態的煙麴黴變成浮遊菌的作用是目前臨床上所用抗真菌藥不具備的，綠原酸破壞生物膜的作用為臨床上能解決由於生物膜引起的耐藥問題提供基礎，展現了其控制煙麴黴生物膜造成的相關感染的潛力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1是本發明實施例2早期及成熟期煙麴黴生物膜掃描電鏡觀察(X 2000倍) A-24h空白組，B-24h 512 μ g/ml的綠原酸組，C_24h 1024 μ g/ml的綠原酸組，D-48h空白組，E-48h 512 μ g/ml的綠原酸組，F_48h 1024 μ g/ml的綠原酸組。
【具體實施方式】
[0011]實施例1
1.製備抗真菌藥物取400mg綠原酸(國家食品藥品檢定研究院，批號110753-201314)用3~5ml 100%的二甲亞碸溶解，配成濃度為102400 μ g/ml的溶液，分裝後於_20°C儲存。
[0012]2.收集菌株於2012年9月到2013年5月在廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科細菌室收集到的30個煙麴黴菌株。質控菌株為ATCC22019近平滑念珠菌，獲贈於廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科細菌室。
[0013]3.製備載體玻璃細胞爬片，直徑13_ (海門市盛邦實驗器材有限公司)，高溫高壓滅囷後備用。
[0014]4.試劑和器材馬鈴薯葡萄糖培養基PDA (北京路橋)、M0PS (Sigma)、RPM1-1640粉(Gibco)、二甲亞碸(Sigma)、無菌96孔細胞培養板(美國Corning)、生化培養箱(常州市偉嘉儀器製造有限公司，型號:SPX-250)、生物安全櫃(蘇州淨化設備有限公司，型號:BHC-1300 II A/B2)，掃 描電鏡(日立，S-3400N)。
[0015]5.製備孢子懸液將步驟2收集的菌株接種到PDA培養皿，置於37°C生化培養箱進行復甦，再轉種到另一個PDA培養皿並置於37°C生化培養箱活化3天後，用5ml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩衝液衝洗平皿表面收集孢子，用20ml MOPS緩衝的RPM1-1640重懸孢子，血細胞計數板調整濃度為I X IO6.孢子.mr1，再用RPM1-1640液體培養基稀釋50倍，得到2倍終濃度的孢子懸液。
[0016]6.藥物敏感試驗微量液基稀釋法，在無菌的96孔細胞培養板的第I至第10孔加入步驟4)製備的孢子懸液，再將步驟I製備的綠原酸置於無菌的96孔細胞培養板的第I至第10孔，第I孔加入量為100 μ 1，第2~10孔依次倍比稀釋至二倍終濃度，第11孔為步驟5製備孢子懸液的生長對照孔，第12孔為MOPS緩衝的RPM1-1640液體培養基，靜置於37°C培養48h ；
7.最低抑菌濃度(MIC)的判定肉眼觀察判斷終點:96培養板各個孔充分混勻之後與生長對照孔比較，100%生長抑制所對應的最低藥物濃度為此藥物的MIC。
[0017]8.早期和成熟期煙麴黴生物膜模型建立以步驟3的玻璃細胞爬片作為載體，將步驟2收集的煙麴黴菌株接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平皿上，置於37°C培養，活化3天之後用5ml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩衝液衝洗平皿表面收集孢子，20ml MOPS緩衝的RPM1-1640重懸孢子，血細胞計數板調整孢子濃度為l~5X105/ml，將Iml孢子懸液加入24孔板中的無菌玻璃細胞爬片上，靜置於37°C生化培養箱中孵育，每日用MOPS緩衝的RPM1-1640換液。培養至24h時載體上為早期煙麴黴生物膜，48h時載體上為成熟期煙麴黴生物膜。
[0018]9.本發明所用藥物濃度空白組為MOPS緩衝的1640液體培養基，綠原酸組分為2個組，除了 MOPS緩衝的1640液體培養基，其中還分別含有亞抑菌濃度的1024 μ g/ml和512 μ g/ml的綠原酸。
[0019]10.藥物對煙麴黴生物膜作用於建模的第24、48h的載體用無菌磷酸鹽緩衝液輕輕漂洗後放入新的24孔板中，按步驟11的濃度加入藥物，每個孔加入1ml，靜置於37°C培養，繼續培養48h，期間每24h用相同的藥物換液。於藥物作用48h後，取出載體，分別行結晶紫半定量和掃描電鏡觀察。
[0020]11.結晶紫半定量用槍頭取磷酸鹽緩衝液輕輕衝洗步驟12載體表面浮遊菌，載體室溫乾燥後，取Iml I %結晶紫染色20min，用磷酸鹽緩衝液輕輕洗脫未結合的結晶紫，室溫乾燥，Iml 95%乙醇脫色3min，取100 μ I洗脫液置於96孔酶標板中，在波長為570nm處測各孔酶標值。以上實驗，每組4個標本，均獨立重複3次。
[0021]12.掃描電鏡觀察從步驟12製備的24孔板中取出載體後按下面步驟操作:(1)
2.5%戊二醛固定2小時；(2)50%、60%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水，每個濃度脫水10分鐘；
(3)臨界乾燥儀乾燥；(4)真空噴鍍金粉；(5)觀察和攝片，條件:電壓20kV，放大倍數2000倍。
[0022]實施例2
實施例1實驗結果
1.藥物的MIC受試煙麴黴菌株對綠原酸的MIC為> 1024 μ g/ml。
[0023]2.綠原酸對煙麴黴生物膜的破壞作用各個組的藥物作用48h後，結晶紫半定量結果顯示，無論是24h還是48h的煙麴黴生物膜，不同濃度的綠原酸在作用48h後，其OD57tl均比空白組降低0°< 0.05)，其中其中1024μ g/ml的綠原酸組比512 μ g/ml的綠原酸組降低更明顯，見表1 。掃描電鏡顯示，無論是24h還是48h的煙麴黴生物膜的空白組均可見濃密的胞外基質包裹住菌絲，菌絲僅隱約可見，而綠原酸組則可以清晰的見到菌絲的形態和分布情況，僅殘留少許胞外基質包繞菌絲，其中1024 μ g/ml的綠原酸組比512 μ g/ml的綠原酸組的胞外基質更少，見圖1。
[0024]表1早期及成熟期煙麴黴生物膜結晶紫半定量的OD57ci值(mean土SD)
【權利要求】
1.一種破壞煙麴黴生物膜的方法，包括製備藥物、收集菌株、製備載體、製備孢子懸液、藥物敏感試驗、製備煙麴黴生物膜載體、藥物對煙麴黴生物膜作用和結晶紫半定量，其特徵在於，用金銀花提取物的綠原酸破壞煙麴黴生物膜，具體步驟如下: 1)製備藥物取400~500mg綠原酸用3~6ml100%的二甲亞碸溶解，配製成濃度為102400 μ g/ml 的溶液，於-20°C ~_25°C儲存； 2)收集菌株收集煙麴黴菌株,質控菌株為近平滑念珠菌； 3)製備載體將直徑為1(T15mm玻璃細胞爬片進行高溫高壓滅菌，作為載體； 4)製備孢子懸液將步驟2)收集的菌株接種到PDA培養皿，置於35~37°C生化培養箱進行復甦，後轉至另一個PDA培養皿並置於35~37°C生化培養箱活化3飛天后，用5~10ml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩衝液衝洗平皿表面收集孢子，用2(T30ml MOPS緩衝的RPM1-1640重懸孢子，用血細胞計數板調整孢子濃度，並用RPM1-1640液體培養液調整濃度為f 3X IO6.孢子?ml-1，再用RPM1-1640液體培養基稀釋50倍，得到2倍終濃度的孢子懸液； 5)藥物敏感試驗微量液基稀釋法，在無菌的96孔細胞培養板的第I至第10孔加入步驟4)製備的孢子懸液，再將步驟I)製備的綠原酸置於無菌的96孔細胞培養板的第I至第10孔，第I孔加入量為100 μ 1，第2~10孔依次倍比稀釋至二倍終濃度，第11孔為步驟4)製備孢子懸液的生長對照孔， 第12孔為MOPS緩衝的RPM1-1640液體培養基，靜置於35~37°C培養48h，獲得綠原酸的最低抑菌濃度MIC ； 6)製備煙麴黴生物I吳 載體 A:早期模型建立將步驟2)收集的菌株接種到PDA培養皿，置於35~37°C培養箱培養活化3飛天，用5~IOml含有0.025%吐溫20的磷酸鹽緩衝液衝洗平皿表面收集孢子，用2(T25ml MOPS緩衝的RPM1-1640重懸孢子，用血細胞計數板調整孢子濃度，並用RPM1-1640液體培養液調整濃度為1~5X IO5.孢子.Hir1Jf f 2ml孢子懸液放在步驟3)製備的載體上，靜置於35~37°C生化培養箱中培養；培養24h時載體上為早期煙麴黴生物膜； B:成熟期模型建立將步驟A製備的煙麴黴生物膜培養48h時載體上為成熟期煙麴黴生物膜； 7)藥物對煙麴黴生物膜作用將步驟6)製備的兩種模型煙麴黴生物膜載體用無菌磷酸鹽緩衝液漂洗，後放入新的無菌載體中，按步驟5)獲得的綠原酸最低抑菌濃度MIC，加入亞抑菌濃度的綠原酸，每個孔加入量為1ml，空白組為MOPS緩衝的RPM1-1640液體培養基，靜置於35~37°C培養48飛0h，後取出載體，進行結晶紫半定量； 8)結晶紫半定量吸取步驟7)載體表面浮遊菌液，室溫乾燥，取f2ml1%結晶紫染色2(T30min，用磷酸鹽緩衝液洗脫未結合的結晶紫，室溫乾燥，用f2ml 95%乙醇脫水3飛min，取100-110μ I洗脫液於96孔酶標板中，在波長為570nm處測各孔酶標值。
2.根據權利要求1所述的破壞煙麴黴生物膜的方法，其特徵在於，所述步驟7)藥物對煙麴黴生物膜作用，靜置培養48飛Oh過程中，間隔24h用與原孔中相同藥物換液。
3.根據權利要求1所述的破壞煙麴黴生物膜的方法，其特徵在於，所述亞抑菌濃度的綠原酸濃度為128 μ g/ml~1024 μ g/ml。
4.根據權利要求1所述的破壞煙麴黴生物膜的方法，其特徵在於，所述綠原酸為400^450mgo
5.根據權利要求1所述的破壞煙麴黴生物膜的方法，其特徵在於，所述步驟5)加入藥物的量為100 μ 1，靜置 於35~36°C培養。
【文檔編號】A61P31/10GK103698515SQ201310720517
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】陳一強, 黃宏, 孔晉亮 申請人:廣西醫科大學