一種afp、gp73、pivka-ⅱ聯合檢測試劑盒的製作方法
2023-05-27 23:31:06 1
一種afp、gp73、pivka-ⅱ聯合檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及生物檢測領域，特別是涉及一種定量檢測甲胎蛋白AFP、高爾基體糖蛋白-73GP73、維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA-Ⅱ的檢測試劑盒及其製備方法和用途。本發明所述檢測試劑盒，包括互相獨立的甲胎蛋白AFP檢測試紙卡、高爾基體糖蛋白-73GP73檢測試紙卡和維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA-Ⅱ檢測試紙卡，所述檢測試紙卡均各自包括底板、及位於底板表面的從加樣端開始依次排列的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。本發明所提供試劑盒首次將AFP、GP73和PIVKA-Ⅱ通過螢光微球免疫層析技術進行檢測，兼具靈敏性和特異性，具有操作快速簡便、結果準確、經濟適用等優點。
【專利說明】-種AFP、GP73、PIVKA- II聯合檢測試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物檢測領域，特別是涉及一種AFP、GP73、PIVKA- II聯合檢測試劑盒 及其製備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 甲胎蛋白（alpha fetoprotein, AFP)是胎兒發育早期由肝臟和卵黃囊合成的一種 糖蛋白，隨著胎兒發育和出生後年齡的增長，血液中AFP水平逐漸下降，成人血清AFP濃度 的參考區間為1_20 iig/L。AFP是肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC)的敏感特 異的標誌物，血清AFP濃度超過400 ii g/L持續4周或者200-400 ii g/L持續5周以上，高度 懷疑肝細胞肝癌；同時血清AFP水平還有可用肝癌的大小判斷、肝癌的療效評估和預後判 斷。但據統計，大約20% -30%的肝細胞肝癌患者血清AFP水平不高；部分良性肝病，包括 急性肝炎、慢性肝炎和大面積的肝壞死，也會有血清AFP的升高。因此，用血清AFP作為肝 細胞肝癌的標誌物存在一定程度的假陽性和假陰性。
[0003] 高爾基體糖蛋白-73 (GolgiProtein 73, GP73)又稱II型高爾基體膜蛋白 (Golgiphosphoprotein2, GOLPH 2)，其在慢性肝炎、肝硬化等病人血清中濃度升高，而在肝 細胞肝癌病人血清中升高更加明顯，和正常人或良性肝病病人之間呈顯著差異。有研究表 明，血清GP73用於肝癌的診斷，優於血清AFP檢測。據文獻報導，GP73檢測肝癌的靈敏度 為69%，特異性為75%。對於早期肝癌的診斷，GP73的敏感性為62%，而AFP敏感性僅 為25%。AFP水平低於20 yg/L的肝癌患者中，有57%的人群GP73水平顯著升高。這表 明，GP73的應用能夠大大提高對AFP陰性的肝癌患者的檢出率。
[0004] 維生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導的蛋白質（Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist_II，PIVKA- II )，又叫脫 羧基凝血酶原（Des-gamma-carboxy prothrombin,DCP)或異常凝血酶原，1984年首次被認定為原發性肝癌的標誌物。肝細胞肝 癌患者血清中PIVKA- II濃度水平遠高於肝硬化和轉移性肝癌患者，而且其血清濃度變化 和患者肝細胞癌的動態變化（手術、治療和復發等）相關。後來的研究證實，PIVKA- II和 AFP檢測可以互為補充，二者的聯合檢測可以將肝細胞肝癌的診斷率提高到84%，僅大約 16%的肝細胞肝癌患者兩者都呈陰性結果。目前PIVKA- II檢測已被列入《日本肝癌學會肝 癌診療規範2009年版》中，用於肝細胞癌高危人群的篩查及原發性肝癌的輔助診斷；我國 衛生部發布的《原發性肝癌診療規範（2011年版）》中用於肝細胞癌輔助診斷的標誌物也包 括 PIVKA-II。
[0005] 綜上，AFP是經典的肝細胞肝癌的生化標誌物，GP73和PIVKA- II是新型肝癌標誌 物的典型代表。相對而言，GP73的敏感性更高，而PIVKA- II的特異性更好，三種指標單獨 應用時都存在一定程度的假陰性和假陽性，如果通過恰當的方式和手段，同時聯合檢測三 項指標，互為補充，將有助於進一步降低肝細胞肝癌臨床診斷的假陰性和假陽性，提高這些 標誌物對肝細胞肝癌的診斷性能，更好地為臨床和患者服務。
【發明內容】
[0006] 鑑於以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在於提供一種定量檢測甲胎蛋白 AFP、高爾基體糖蛋白-73GP73、維生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II的檢 測試劑盒及其製備方法和用途，用於解決現有技術中的問題。
[0007] 為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種定量檢測甲胎蛋白AFP、高爾 基體糖蛋白-73GP73、維生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II的檢測試劑 盒，包括互相獨立的甲胎蛋白AFP檢測試紙卡、高爾基體糖蛋白-73GP73檢測試紙卡和維 生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II檢測試紙卡，所述檢測試紙卡均各自 包括底板、及位於底板表面的從加樣端開始依次排列的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸 水墊，所述甲胎蛋白AFP檢測試紙卡的金標墊上包含甲胎蛋白AFP抗體，所述高爾基體糖 蛋白-73GP73檢測試紙卡的金標墊上包含高爾基體糖蛋白-73GP73抗體，所述維生素 K缺 乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II檢測試紙卡的金標墊上包含維生素 K缺乏或拮 抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II抗體，所述各硝酸纖維素膜上包被有檢測線和質控線， 所述金標墊上的甲胎蛋白AFP抗體、高爾基體糖蛋白-73GP73抗體和維生素 K缺乏或拮抗 劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II抗體採用螢光微球標記。
[0008] 優選的，各個金標墊上的抗體採用180nm突光微球標記，EX(nm) = 650/Em(nm)= 670,具有信號受背景幹擾小，檢測靈敏度高，結果重複性好的優點。
[0009] 優選的，所述底板為PVC底板。
[0010] 優選的，所述各硝酸纖維素膜上，檢測線位於離加樣端較近一側，質控線位於離加 樣端較遠一側。
[0011] 優選的，所述甲胎蛋白AFP檢測試紙卡的檢測線上包被有甲胎蛋白AFP抗體；所述 高爾基體糖蛋白-73GP73檢測試紙卡的檢測線上包被有高爾基體糖蛋白-73GP73抗體；所 述維生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II檢測試紙卡的檢測線上包被有維 生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II抗體。
[0012] 每個檢測卡中金標墊上的抗體與檢測線上的抗體可以是相同的抗體，也可以是不 同的抗體。
[0013] 優選的，各質控線上包被羊抗鼠抗體。
[0014] 優選的，所述各樣品墊採用緩衝液處理，所述緩衝液選自PBS緩衝液、TriS-HCl緩 衝液、甘氨酸緩衝液、硼酸鹽緩衝液和檸檬酸-磷酸鹽緩衝液中的一種或多種的組合，緩衝 液的濃度為20-200mM。
[0015] 優選的，本發明所述的各金標墊還經過預處理，預處理時所使用的預處理緩衝液 選自甘氨酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液、硼酸鹽緩衝液的一種或多種的組合，緩衝液的濃度為 5_50mM〇
[0016] 優選的，所述緩衝液還包括反應增強劑，所述反應增強劑選自PEG4000、PEG6000、 PEG8000和PEG20000中的任意一種，所述反應增強劑的濃度為10?50g/L。
[0017] 優選的，所述緩衝溶液還包括表面活性劑，所述表面活性劑選自S-19TWEEN 20、 S-20TWEEN 80、S-13TRIT0N X-45、S-14TRIT0N X-100、S-15TRIT0N X305 中的任意一種或多 種的組合，所述表面活性劑的濃度為10?50g/L。
[0018] 優選的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果，本發明所述的各金標墊 在預處理時所使用的預處理緩衝液包括下列組分：水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六偏磷酸 鈉和甘氨酸，且水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六偏磷酸鈉、甘氨酸的總濃度為3. 5 - 7. 5g/ L，緩衝液的pH值為7. 2 -7.6。
[0019] 優選的，各組分在緩衝液中的濃度為：
[0020]
【權利要求】
1. 一種定量檢測甲胎蛋白AFP、高爾基體糖蛋白-73GP73、維生素K缺乏或拮抗劑-II 誘導產生的蛋白PIVKA- II的檢測試劑盒，包括互相獨立的甲胎蛋白AFP檢測試紙卡、高爾 基體糖蛋白-73GP73檢測試紙卡和維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II 檢測試紙卡，所述檢測試紙卡均各自包括底板、及位於底板表面的從加樣端開始依次排列 的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述甲胎蛋白AFP檢測試紙卡的金標墊上包含 甲胎蛋白AFP抗體，所述高爾基體糖蛋白-73GP73檢測試紙卡的金標墊上包含高爾基體糖 蛋白-73GP73抗體，所述維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II檢測試紙 卡的金標墊上包含維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II抗體，所述各硝 酸纖維素膜上包被有檢測線和質控線，所述金標墊上的甲胎蛋白AFP抗體、高爾基體糖蛋 白-73GP73抗體和維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II抗體採用螢光微 球標記。
2. 如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述各硝酸纖維素膜上，檢測線位於 離加樣端較近一側，質控線位於離加樣端較遠一側。
3. 如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述甲胎蛋白AFP檢測試紙卡的 檢測線上包被有甲胎蛋白AFP抗體；所述高爾基體糖蛋白-73GP73檢測試紙卡的檢測線 上包被有高爾基體糖蛋白-73GP73抗體；所述維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋 白PIVKA- II檢測試紙卡的檢測線上包被有維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白 PIVKA- II 抗體。
4. 如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，各質控線上包被羊抗鼠抗體。
5. 如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述各樣品墊採用緩衝液處理，所述 緩衝液選自PBS緩衝液、Tris-HCl緩衝液、甘氨酸緩衝液、硼酸鹽緩衝液和檸檬酸-磷酸鹽 緩衝液中的一種或多種的組合，緩衝液的濃度為20-200mM。
6. 如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述各金標墊採用緩衝液處理，所述 緩衝液選自甘氨酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液、硼酸鹽緩衝液的一種或多種的組合，緩衝液的 濃度為5-50mM。
7. 根據權利要求6所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述緩衝液中還包括反應增強劑， 所述反應增強劑選自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一種，所述反應增強 劑的濃度為10?50g/L。
8. 如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，還包括卡殼，所述卡殼包括背卡和上 蓋，所述背卡設有三個平行的試紙卡卡槽，所述試紙卡嵌於所述試紙卡卡槽內，所述上蓋設 有三個測試窗和三個加樣孔，所述三個測試窗的位置分別與三個試紙卡的檢測線和質控線 的位置相配合，所述三個加樣孔的位置與三個試紙卡的樣品墊的位置相配合。
9. 如權利要求8所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述三個加樣孔之間還設有連接三 個加樣孔的橫槽。
10. 根據權利要求1?9任一權利要求所述的檢測試劑盒的製備方法，具體包括如下步 驟： 1)用螢光微球標記的甲胎蛋白AFP抗體、高爾基體糖蛋白-73GP73抗體和維生素K缺 乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II抗體溶液分別噴塗各自對應的金標墊，製得分別 包含甲胎蛋白AFP抗體、高爾基體糖蛋白-73GP73抗體和維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導 產生的蛋白PIVKA- II抗體的金標墊； 2) 在甲胎蛋白AFP檢測試紙卡的硝酸纖維素膜的檢測線和質控線上分別噴塗甲胎蛋 白AFP抗體及羊抗鼠抗體；在高爾基體糖蛋白-73GP73檢測試紙卡的硝酸纖維素膜的檢測 線和質控線上分別噴塗高爾基體糖蛋白-73GP73抗體及羊抗鼠抗體；在維生素K缺乏或拮 抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II檢測試紙卡的硝酸纖維素膜的檢測線和質控線上分別 噴塗維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導產生的蛋白PIVKA- II抗體及羊抗鼠抗體； 3) 將三套樣品墊、步驟1)製備的三套金標墊、步驟2)製備的三套硝酸纖維素膜、三套 吸水墊依次粘貼在底板上，切裁製得檢測試紙卡；最後將檢測試紙卡裝入卡殼製得檢測試 劑盒。
【文檔編號】G01N33/68GK104407155SQ201410736252
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月5日 優先權日:2014年12月5日
【發明者】潘能科 申請人:重慶乾德生物技術有限公司