從牛初乳中製備多種生物活性物質的方法
2023-06-13 07:58:06
專利名稱：從牛初乳中製備多種生物活性物質的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備多種生物活性物質的方法，更具體地說，是一種從牛初乳中同時製備多種生物活性物質的系統方法，這種方法可以最大程度利用牛初乳原料，並且降低製造成本。
發明技術背景初乳是指分娩後72小時內母體分泌的乳液。多年科學和醫學研究發現，牛初乳含有多種珍貴的生物活性物質，具有保健、抗病、抗衰老等功效，其效用可以和人乳相媲美，某些研究人員認為牛乳是迄今為止所發現的最有益的人體健康的食品。
牛初乳的研究始於70年代，30多年來各國科學家在牛初乳成份及其對人體作用方面的研究都有很大進展，綜合目前國際上的研究成果，初乳中的活性物質可以分為兩大類免疫因子和生長因子。
牛初乳中的免疫因子可以抵抗病毒、細菌、酵母菌、真菌、過敏原和其他毒素。初乳中含有5種免疫球旦白，分別是IgG，IgD，IgM，IgA和IgE，其中IgG含量最高，在人初乳中，IgG僅佔2％左右，而牛初乳中IgG含量可達8％-25％，免疫球旦白對於病毒性感染、細菌性感染、寄生蟲和酵母菌都有良好的防禦作用，高質量牛初乳中免疫球旦白應最低達到20％。牛初乳中至少含有19種致病菌的抗體，包括沙門氏菌、大腸桿菌和鏈球菌的抗體。牛初乳中還含有富脯胺基酸多肽(PRP)，可以調節人體胸腺活動而增強人體免疫功能；乳鐵旦白對癌症、愛滋病感染、皰疹、慢性疲勞等疾病有效；乳清旦白對於癌症和病毒有很好抵禦作用，以及細胞活素和溶菌酶等免疫增強和調節物質。
牛初乳中還含有豐富的生長因子，醫學研究表明，牛初乳中的重要生長因子除了有助於正常的生長之外，對人體組織修復有重要的作用。牛初乳中含量最豐富的生長因子是類胰島素生長因子I和II(GIF-I和GIF-II)，它們幫助機體有效地進行脂肪代謝和葡萄糖代謝，增加葡萄糖利用，增強糖耐量。牛初乳中還含有轉移生長因子(TGFAB)，血小板誘導生長因子(PDGF)，表皮生長因子、骨髓生長因子等。
目前有多項技術用來提取製備牛初乳中生物活性物質，美國專利4,526,715介紹了一種從牛初乳中通過幾種層析分離步驟製備免疫球旦白的方法。美國專利3,128,230介紹了一種從牛初乳中製備可用於治療各種細菌感染的產品和方法。西德專利2,813,284和歐洲專利EP-A0,046,909及EP-A0,064,103敘述了從初乳中製備含免疫球旦白產品的方法，該產品可作為抗感染產品。中國發明專利96116428介紹了一種從牛初乳中提取類胰島素生長因子的製備方法。
目前技術的缺陷為僅從牛初乳中製備某一種特定生物活性成份，而牛初乳中其餘珍貴的生物活性成份被廢棄，這無疑是一種資源浪費，也會明顯增加製造成本。
本發明所要解決的技術問題是，採用系統的工藝和方法同時從牛初乳中製備多種生物活性成份，最大程度地利用牛初乳這一珍貴資源，同時降低各個單一成份的製備成本。
發明內容
本發明解決上述技術問題所採用的技術方案是，採用系統方法逐個從牛初乳中提取單個生物活性成份。其特徵是，將新鮮收取或冷凍牛初乳用離心方式脫脂，然後用酸製劑將脫脂初乳調整PH值至強酸性，直接用分子量8000～20,000的超微濾膜進行超濾，收集過濾液，用鹼性製劑調整過濾液PH至接近弱酸性或中性，用分子量3,000～6,000的超微濾膜進行濃縮，濃縮物送入冷凍乾燥裝置進行冷凍乾燥成粉狀物，內含豐富的類胰島素生長因子。第一次超濾的濃縮物加鹼性製劑調整PH至弱酸性或中性並加熱後離心沉澱酪旦白，收集的酪旦白用旦白水解酶在一定溫度下水解，加工製作酪旦白磷酸多肽(CPPs)。殘餘的乳清液用分子量80,000～160,000的超濾膜再次濃縮，濃縮物噴霧乾燥或冷凍乾燥成粉狀物質，富含各種免疫球旦白。
本發明的技術解決方案也可以採用另一種方法和程序，其特徵是將牛初乳用離心方式脫脂，然後用酸性製劑將脫脂初乳酸化，同時，稀釋脫脂初乳，用低分子量超微濾膜進行超濾分離(分子量8,000～20,000濾膜)，收集過濾液，用鹼性製劑調整過濾液PH至弱酸性或中性，用分子量3,000～6,000的超微濾膜進行濃縮，濃縮物進行冷凍乾燥成千粉，內含豐富的類胰島素生長因子。第一次超濾濃縮物加鹼性製劑調整PH至弱酸性或中性後，直接用分子量80,000～160,000的超微濾膜進行超濾分離，分離濃縮物直接採用冷凍乾燥或噴霧乾燥的方法製備富含免疫球旦白的乾粉。而過濾液高溫旦白變性後加入旦白水解酶在一定溫度條件下進行旦白水解過程，結束時高溫滅活旦白水解酶，噴霧乾燥成乾粉，其中，含有豐富的酪旦白磷酸多肽。如果希望製備高純度磷酸多肽，可以在酪旦白水解結束後，用分子量4,000～10,000的超濾膜進行超濾分離，過濾液噴霧乾燥，即可獲得高純度磷酸多肽。
通過上述工藝和方法，從牛初乳中加工製備高生物活性類胰島素生長因子(IGF-1)製劑、酪旦白磷酸多肽(CPPs)製劑和高生物活性的免疫球旦白製劑，本發明的技術特徵是，收集的牛初乳是母牛分娩三日內(72小時)的牛初乳，收集的牛初乳是新鮮或冷凍狀態(4℃)，對收集的牛初乳進行脫脂程序，可以採用冷凍離心的方法，離心速度2,000～4,000轉/分，最佳為3,000轉/分，離心時溫度不高於10～28℃，離心後去除離心液表面的脂肪。
本發明的技術特徵是，採用酸製劑調整脫脂初乳的PH值至強酸性，採用的酸製劑可以是HCL或其他酸製劑，調整PH值至2.2～3.5，優選2.8～2.9，調整PH值至規定的區間後，採用分子量為8,000～20,000的超濾膜，採用常規超濾設備，最理想的是採用切面交錯流體超濾設備進行分離，收集過濾液，用鹼性製劑調整過濾液的PH值至5.5～7.5，優選5.8～6.2，調整PH值後的過濾液採用分子量為3,000～6,000的超濾膜，優選為分子量4,000～5,000超濾膜採用常規超濾設備濃縮至起始容量10％～60％，優選20％～30％後，送至冷凍乾燥設備，製備冷凍乾燥粉，內含豐富的類胰島素生長因子。在調整PH值後，也可以在過濾液中加入相當於過濾液1倍～5倍，優選2倍～3倍的無菌蒸鎦水稀釋過濾液後進行濃縮，尤其採用切面交錯流體超濾裝置時更應採用後一步驟。與此同時，收集第一次超濾分離的濃縮物，加鹼性製劑，可以是NaOH也可以是其他鹼性製劑，調整濃縮物PH至弱酸性或中性，PH值3.8～5.2，優選4.5～4.8，調整濃縮物PH值後，加熱析出酪旦白，加熱溫度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加熱時間15分鐘～90分鐘，最好30分鐘～45分鐘，最好是加熱至看到乳水明顯分離，然後用離心機離心沉澱析出酪旦白，離心速度3,000～6,000轉/分，優選5,000轉/分，收集離心上清液，用分子量80,000～160,000的超微濾膜進行分離和濃縮，濃縮物冷凍乾燥或噴霧乾燥成乾粉，即獲得含生物活性免疫球旦白的製劑。而離心沉澱的酪旦白被收集後，在75℃～85℃下加熱10～30分鐘，然後加入胰旦白酶和/或胰凝乳旦白酶，其中酶的重量與旦白重量約0.4～1.2％，在溫度30℃～50℃和PH值6.5～8.0條件下進行2～6小時，在水解過程結束後，歷經10分鐘85℃或45秒130℃的酶滅活程序，然後噴霧乾燥成含有大量磷酸多肽的旦白水解產物，如果希望得到更高純度的磷酸多肽，在高溫酸滅活程序後，將旦白水解溶液用分子量為4,000～10,000的超微濾膜分離過濾，過濾液噴霧乾燥，即可得到高純度的酪旦白磷酸多肽製劑。
本發明的技術特徵是，為了製備高生物活性的免疫球旦白製劑，在脫脂初乳酸化用分子量為8,000～20,000的超濾膜分離後，濃縮物加入1倍～5倍，優選2倍～3倍的蒸餾水稀釋，直接採用分子量為80,000～160,000，優選分子量為100,000～120,000的超微濾膜，採用超濾分離設備，優選切面交錯流體過濾(TFF)設備進行分離，濃縮物直接冷凍乾燥成粉，內含高生物活性的免疫球旦白，也可以採用噴霧乾燥方法乾燥成粉，而含有大量酪旦白的過濾液可以調整PH至4.5～4.8，優選4.7，加熱50℃，半小時至1小時後，用離心機離心沉澱，離心速度5,000轉/分，收集沉澱物，進行旦白水解過程。
本發明與現有技術相比的優點是，採用系統方法，一次性從牛初乳中提取多種生物活性物質，減少了原材料採集、運輸、保藏的費用，而且一次系統加工過程獲得多種收益，大幅度降低了加工成本。同時本發明的工藝中採取的措施保護了生物活性物質的生物活性，臨床使用效果更佳。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明實施例1收集母牛分娩後3日內分泌的牛初乳，冷凍離心脫脂，速度為3,000轉/分，離心時間為30分鐘，去除離心液上層脂肪，在脫脂初乳內滴入2N HCL調整PH值至2.8，採用裝有分子量為10,000超微濾膜的美國Pall公司生產的切面交錯流體過濾設備(TFF)進口壓為3500千克/釐米2，出口壓0.4千克/釐米2，料液溫度＜35℃，收集過濾液，用2N NaOH調PH至6.5，過濾液繼續用同樣設備和參數，但改用分子量為5,000的超微濾膜進行濃縮，棄去過濾液，收集濃縮液，送入冷凍乾燥裝置冷凍乾燥成粉，製備內含豐富類胰島素生長因子的製劑。
同步收集第一次過濾分離的濃縮液，用2N NaOH調節PH值至4.7，加熱至50℃，30分鐘，使酪旦白凝固，用5000轉/分速度離心15分鐘，收集離心上清液，用分子量100,000的超濾膜及上述超濾裝置濃縮，濃縮物直接噴霧乾燥成粉，製備含有免疫球旦白的製劑。
收集離心沉澱的酪旦白，進行預熱處理，在75℃溫度下保持30分鐘，冷卻至50℃時加胰旦白酶，胰旦白酶佔旦白重量1％，在30℃～50℃溫度下進行2～6小時，在水解結束後，向水解產物內注入130℃蒸汽45分鐘，噴霧乾燥成粉，製備含有豐富酪旦白磷酸多肽的製劑。
實施例2收集牛初乳。以2000轉/分速度離心脫脂，用2N HCL滴入調節脫脂初乳至PH2.9，採用12,000分子量的超微濾膜用板框式超濾器過濾分離，過濾液用2N NaOH調整PH至6.2，換用分子量為4,000的超濾膜在板框式超濾器濃縮，濃縮物冷凍乾燥成內含豐富類胰島素生長因子的乾粉。第一次超濾分離的濃縮物用2N NaOH調節PH至4.7，用分子量為120,000的超濾膜分離，濃縮液直接冷凍乾燥成粉，含有大量生物活性物質的免疫球旦白。而過濾液加熱至85℃溫度下20分鐘預熱，冷卻至45℃時加入胰凝乳旦白酶，佔旦白重量的0.8％，在30-50℃溫度保持2-6小時，用85℃加熱1分鐘滅活酶，旦白水解液用分子量為10,000的中空纖維或超濾膜分離過濾，過濾液在85℃溫度下噴霧乾燥成酪旦白磷酸多肽粉。
權利要求
1.一種從牛初乳中同時製備多種生物活性物質的系統方法，其特徵是在牛初乳脫脂後酸化，使類胰島素生長因子和結合旦白脫離，採用超濾方法分離類胰島素生長因子，分離液經濃縮後製備冷凍乾燥粉，然後通過超濾方法分離免疫球旦白，濃縮後製備粉末物，同時採用超濾或調整PH值後加熱凝固方式獲取酪旦白，經水解旦白酶作用後製備酪旦白磷酸多肽，採用這種方法可以最大程度地利用牛初乳原料，大幅度降低製造成本。
2.按照權利要求1所述的方法，採用系統方法逐個從牛初乳中提取單個生物活性成份，其特徵是，將新鮮收取或冷凍牛初乳用離心方式脫脂，然後用酸製劑將脫脂初乳調整PH值至強酸性，直接用分子量8,000～20,000的超微濾膜進行超濾，收集過濾液，用鹼性製劑調整過濾液PH至接近弱酸性或中性，用分子量3,000～6,000的超微濾膜進行濃縮，濃縮物送入冷凍乾燥裝置進行冷凍乾燥成粉狀物，內含豐富的類胰島素生長因子；第一次超濾的濃縮物加鹼性製劑調整PH至弱酸性或中性，並加熱後離心沉澱酪旦白，收集的酪旦白用旦白水解酶在一定溫度下水解，加工製作酪旦白磷酸多肽(CPPS)；殘餘的乳清液用分子量80,000～160,000的超濾膜再次濃縮，濃縮物噴霧乾燥或冷凍乾燥成粉狀物質，富含各種免疫球旦白。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵是，本發明的技術解決方案也可以採用另一種方法和程序，將牛初乳用離心方式脫脂，然後，用酸性製劑將脫脂初乳酸化，同時，稀釋脫脂初乳，用低分子量超微濾膜進行超濾分離(分子量8,000-20,000濾膜)收集過濾液，用鹼性製劑調整過濾液PH至弱酸性或中性，用分子量3,000-6,000的超微濾膜進行濃縮，濃縮物進行冷凍乾燥成乾粉，內含豐富的類胰島素生長因子；第一次超濾濃縮物加鹼性製劑調整PH至弱酸性或中性後，直接用分子量80,000-160,000的超微濾膜進行超濾分離，分離濃縮物直接採用冷凍乾燥或噴霧乾燥的方法製備富含免疫球旦白的乾粉；而過濾液高溫旦白變性後加入旦白水解酶在一定溫度條件下進行旦白水解過程，結束時高溫滅活旦白水解酶，噴霧乾燥成乾粉，其中，含有豐富的酪旦白磷酸多肽，如果希望製備高純度磷酸多肽，可以在酪旦白水解結束後，用分子量4,000-10,000的超濾膜進行超濾分離，過濾液噴霧乾燥，即可獲得高純度磷酸多肽。
4.按照權利要求1所述的方法，其特徵是，通過該工藝和方法，從牛初乳中加工製備高生物活性類胰島素生長因子(IGF-1)製劑、酪旦白磷酸多肽(CPPs)製劑和高生物活性的免疫球旦白製劑。
5.按照權利要求1所述的方法，本發明的技術特徵是，收集的牛初乳是母牛分娩三日內(72小時)的牛初乳，收集的牛初乳是新鮮或冷凍狀態(4℃)，對收集的牛初乳進行脫脂程序，可以採用冷凍離心的方法，離心速度2,000～4,000轉/分，(最佳為3,000轉/分，離心時溫速度不高於10℃～28℃，離心後去除離心液表面的脂肪。
6.按照權利要求1所述的方法，本發明的技術特徵是，採用酸製劑調整脫脂初乳的PH值至強酸性，採用的酸製劑可以是HCL或其他酸製劑，調整PH值至2.2～3.5，優選2.8～2.9，調整PH值至規定的區間後，採用分子量為8,000～20,000的超濾膜，採用常規超濾設備，最理想的是採用切面交錯流體超濾設備進行分離，收集過濾液，用鹼性製劑調整過濾液的PH值至5.5～7.5，優選5.8～6.2，調整PH值後的過濾液採用分子量為3,000～6,000的超濾膜，優選為分子量4,000～5,000超濾膜採用常規超濾設備濃縮至起始容量10％～60％，優選20％～30％後，送至冷凍乾燥設備，製備冷凍乾燥粉，內含豐富的類胰島素生長因子，在調整PH值後，也可以在過濾液中加入相當於過濾液1倍～5倍，優選2倍～3倍的無菌蒸鎦水稀釋過濾液後進行濃縮，尤其採用切面交錯流體超濾裝置時更應採用後一步驟，與此同時，收集第一次超濾分離的濃縮物，加鹼性製劑，可以是NaOH也可以是其他鹼性製劑，調整濃縮物PH至弱酸性或中性，PH值3.8～5.2，優選4.5～4.8，調整濃縮物PH值後，加熱析出酪旦白，加熱溫度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加熱時間15分鐘～90分鐘，最好30分鐘～45分鐘，最好是加熱至看到乳水明顯分離，然後用離心機離心沉澱析出的酪旦白，離心速度3,000～6,000轉/分，優選5,000轉/分，收集離心上清液，用分子量80,000～160,000的超微濾膜進行分離和濃縮，濃縮物冷凍乾燥或噴霧乾燥成乾粉，即獲得含生物活性免疫球旦白的製劑，而離心沉澱的酪旦白被收集後，在75℃～85℃下加熱10～30分鐘，然後加入胰旦白酶和/或胰凝乳旦白酶，其中酶的重量與旦白重量約0.4～1.2％，在溫度30℃～50℃和PH值在6.5～8.0條件下進行2～6小時，在水解過程結束後，歷經10分鐘85℃或45秒130℃的酶滅活程序，然後噴霧乾燥成含有大量磷酸多肽的旦白水解產物，如果希望得到更高純度的磷酸多肽，在高溫酸滅活程序後，將旦白水解溶液用分子量為4,000～10,000的超微濾膜分離過濾，過濾液噴霧乾燥，即可得到高純度的酪旦白磷酸多肽製劑。
7.按照權利要求1所述的方法，本發明的技術特徵是，為了製備高生物活性的免疫球旦白製劑，在脫脂初乳酸化、用分子量為8,000～20,000的超濾膜分離後，濃縮物加入1倍～5倍，優選2倍～3倍的蒸餾水稀釋，直接採用分子量為80,000～160,000，優選分子量為100,000～120,000的超微濾膜，採用超濾分離設備，優選切面交錯流體過濾(TFF)設備進行分離，濃縮物直接冷凍乾燥成粉，或採用噴霧乾燥方法乾燥成粉，內含高生物活性的免疫球旦白，而含有大量酪旦白的過濾液可以調整PH至4.5～4.8，優選4.7，加熱50℃，半小時至1小時後，用離心機離心沉澱，離心速度5,000轉/分，收集沉澱物，進行旦白水解過程。
全文摘要
一種從牛初乳中同時製備多種生物活性物質的系統方法，特徵是在牛初乳脫脂後酸化，使類胰島素生長因子和結合蛋白脫離，採用超濾方法分離類胰島素生長因子，分離液經濃縮後製備冷凍乾燥粉，然後通過超濾方法分離免疫球蛋白，濃縮後製備粉末物，同時採用超濾或調整pH值後加熱凝固方式獲取酪蛋白，經水解蛋白酶作用後製備酪蛋白磷酸多肽，採用這種方法可以最大程度利用牛初乳原料，大幅度降低製造成本。
文檔編號A61K35/20GK1557837SQ200410015868
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月15日 優先權日2004年1月15日
發明者高春平 申請人:高春平