一種「頑拗」植物基因組dna的提取技術的製作方法
2023-06-13 05:00:41 1
專利名稱：一種「頑拗」植物基因組dna的提取技術的製作方法
技術領域：
本發明專利屬於生物技術領域，涉及一種「頑拗」植物基因組DNA提取技術，利用該技術可以明顯提高基因組DNA質量，主要應用於細胞內含有大量的多糖、多酚、蹂質以及桂皮醛、桂皮酸等次生代謝物的植物材料基因組DNA提取中。
背景技術：
由於「頑勘」植物如紅楠(Machilusthunbergii Sieb. et Zucc.)、華東楠(Machilus IeptophyllaHand. -Mazz.)和龍眼(Dimocarpus longan Lour.)等細胞內含有大量的多糖、多酚、蹂質以及桂皮醛、桂皮酸等次生代謝物，不僅能干擾DNA的提取過程，而且使提取的DNA溶液粘稠，樣品呈棕褐色，進而不能用作分子生物分析和研究的PCR模板，分子生物學家稱其為「頑拗」植物。
目前國內外也已經開展了部分「頑拗」植物基因組DNA提取技術的研究，成功提取了如龍眼、蒸枝(Litchi chinensis)和西南樣(Betula alnoides Buch Ham.)等植物的基因組DNA。因為幼葉多糖、多酚等次生代謝物較少，基因組DNA提取較為容易，所以以往研究中所用植物材料多為幼葉，較少利用成熟葉片和矽膠乾燥葉片。為了能從「頑拗」植物不同組織材料中提取高質量的基因組DNA，本發明專利以紅楠為例，利用紅楠幼葉、成熟葉和矽膠乾燥葉片，成功提取了紅楠高質量基因組DNA，滿足了分子生物學試驗的需求。
發明內容
本發明的目的是提供一種「頑拗」植物基因組DNA提取技術，方法簡單，效果明顯，能成功提取不同植物組織材料的基因組DNA。本發明為實現上述目的所採用的技術方案是由於紅楠含有大量的多糖、鞣質、多酚等次生代謝物，在提取過程中經裂解液處理後，細胞破碎，次生代謝物被釋放出來，使提取液變得異常粘稠，難以操作，導致提取的DNA質量差，溶解困難。在本發明中用洗脫緩衝液進行洗脫，同時在65°C水浴核裂解後加入7. 5M醋酸銨溶液會在很大程度上解決粘稠問題；先用酚氯仿異戊醇(25 24 I)抽提，再用氯仿異戊醇(24 I)抽提，將蛋白質和酚抽提乾淨；由於次生代謝物的存在，常規方法提取會使這些物質與DNA發生不可逆的結合使DNA呈褐色、粘稠，影響DNA質量，因此不能用於PCR擴增和酶切等分子生物學研究。加入PVP (多酚絡合物)和β-巰基乙醇(抗氧化劑)能夠防止多酚物質氧化成醌類，避免褐變的發生。經過多次試驗發現，巰基乙醇和PVP現用現配效果最好。本發明基因組DNA提取技術與傳統方法相比，具有顯著的特點I.利用洗脫液進行洗脫，能成功分離出多糖、多酚等次生代謝物質，解決離心上層液粘稠問題；2.同時加入PVP和β -巰基乙醇能夠防止多酚物質氧化成醌類，避免褐變的發生。
四
五具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明I溶液配製洗脫緩衝液100mMTris-HCI, pH 8. O ；1. 4M NaCl ；20mM EDTA, PH = 8. 0 ；2%β-琉基乙醇(V/V) ；2%PVP(ff/V)(聚乙烯毗咯烷酮K-40) ；β 一琉基乙醇和PVP在使用前加入；2 X CTAB提取緩衝液洗脫緩衝液中加入2%的CTAB (W/V)；其他試劑參考常規配製方法。 2提取過程2. I將O. Ig左右撕碎的新鮮葉片或O. 05g左右的矽膠乾燥葉片放入瑪瑙研缽中，加少量石英砂，再倒入少許液氮，待液氮快揮發完時迅速用力研磨，並將磨碎的葉片加入到事先裝有ImL洗脫緩衝液的離心管中，顛倒混勻並冰浴5min ；2. 2將離心管在高速離心機(12000轉/分鐘)離心15min，並棄去上清液；2. 3加入800 μ L預熱至65°C的提取緩衝液(2 X CTA B)於黃口塑料試管中，並把塑料試管置於65°C的水浴鍋中lh，期間每過15min試管顛倒搖動一次；2. 4加入150 μ L 7. 5Μ醋酸銨溶液，混勻，並冰浴30min ；2. 5試管於高速離心機(12000轉/分鐘)離心15min，用移液器吸取700 μ L上清液至新的離心管中，並加入等體積(700yL)的酚-氯仿-異戊醇混合試劑(體積比25 24 I)，混勻，12000轉/分鐘離心15min ;用移液器吸取700 μ L上清夜轉移至新的離心管中(I. 5mL)；2. 6加入等體積(700 μ L)氯仿-異戊醇混合試劑，搖勻，12000轉/分鐘離心15min，用移液器吸取500 μ L上清液再次轉移至新的離心管中；2. 7加入200 μ L 5Μ的氯化鈉溶液和600 μ L(-20°C )預冷的無水乙醇，輕輕混勻，離心管放置於低溫冰箱(_20°C以下)I小時以上或者過夜；2. 812000 轉 / 分鐘離心 15min ；2. 9棄去上清液，加入500 μ L 70%乙醇溶液，12000轉/分鐘離心5min，清晰看到DNA沉澱；2. 10重複步驟2. 9 一次，再用冰凍的無水乙醇洗一次；2. 11將離心管放在無菌操作颱風幹約30min ；2. 12加入80yL I X TE，輕輕搖動離心管以溶解DNA沉澱，溶液置於_20°C冰箱中保存。
權利要求
1.「頑拗」植物基因組DNA技術，其特徵是用洗脫緩衝液進行洗脫，同時在65°C水浴核裂解後加入7. 5M醋酸銨溶液會在很大程度上解決粘稠問題；先用酚氯仿異戊醇(25 24 I)抽提，再用氯仿異戊醇(24 I)抽提，將蛋白質和酚抽提乾淨；同時加入PVP(多酚絡合物)和￠-巰基乙醇能夠防止多酚物質氧化成醌類，避免褐變的發生。￠-巰基乙醇和PVP現用現配效果好。
2.根據權利要求I所述的植物基因組DNA提取技術，其特徵是洗脫緩衝液的配製，主要包括 IOOmM Tris-HCI，pH 8. 0 ；1. 4M NaCl ；20mM EDTA, PH = 8. 0 ；2% 3 -琉基乙醇(V/V) ；2% PVP(W/V)(聚乙烯毗咯烷酮K-40)。
3.根據權利要求I所述的植物基因組DNA提取技術，其特徵是用洗脫緩衝液進行洗脫，同時在65°C水浴核裂解後加入150ul 7. 5M醋酸銨溶液會在很大程度上解決粘稠問題。
4.根據權利要求I所述的植物基因組DNA提取技術，其特徵是利用酚氯仿異戊醇(25 24 I)抽提，再用氯仿異戊醇(24 I)抽提，將蛋白質和酚抽提乾淨。
5.根據權利要求I所述的植物基因組DNA提取技術，其特徵是同時加入PVP(多酚絡合物)和3 -巰基乙醇能夠防止多酚物質氧化成醌類，避免褐變的發生。
全文摘要
「頑拗」植物基因組DNA的提取技術，屬於生物技術領域。本技術利用洗脫液能成功分離出多糖、多酚等次生代謝物質，解決離心上層液粘稠問題；利用酚；氯仿；異戊醇抽提，再用氯仿；異戊醇抽提，可將蛋白質和酚等抽提乾淨；防止多酚物質氧化成醌類，避免褐變的發生，成功提取「頑拗」植物高質量基因組DNA。主要應用於細胞內含有大量的多糖、多酚、蹂質以及桂皮醛、桂皮酸等次生代謝物的植物材料基因組DNA提取中。
文檔編號C12N15/10GK102807977SQ20111014817
公開日2012年12月5日 申請日期2011年5月31日 優先權日2011年5月31日
發明者劉軍 申請人:劉軍