真核細胞的增強內轉譯因子及其用途的製作方法
2023-06-22 10:42:26
專利名稱：真核細胞的增強內轉譯因子及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及為真核細胞的多順反子基因表達而構建的增強內轉譯因子及其應用，具體涉及腦心肌炎病毒的增強內轉譯因子及其應用。
內轉譯因子，也稱內核蛋白體的進入位點(IRES)。用IRES來驅使多種基因的轉譯和表達是近十年來發展的一種表達技術，尤其在近五年內這種技術被研究得較多而且被廣泛地應用於基因治療和重組蛋白表達的載體組建。其特點是兩個基因編碼順序利用IRES的連接存在於同一個信使RNA(mRNA)，使得兩個基因的表達相關相連。這在某些應用上是有意義的，例如，當要表達一個蛋白複合體的兩個亞基時，或者通過一個指示蛋白(如螢光蛋白)來監測另一個藥用蛋白的表達工藝過程。最常用的IRES來自於腦心肌炎病毒(EMCV)。它已經被美國專利局註冊(US Patent#4,937,190)。該專利中描述的是原始的較弱的IRES，沒有被突變修改過。
EMCV是最大動物病毒族(小RNA病毒)之一，象小RNA病毒家族的其它成員一樣，EMCV具有一個單鏈RNA基因組。與大多數真核生物的mRNA不同，它的RNA基因在5′末端上缺乏一個常規帽型結構。該結構為核糖體掃描模型所提出的。它的5′非轉譯區，其長度為834核苷酸(nt)，並由多個AUG三聯體組成，據信可引起內核糖體的結合併指導帽型獨立轉譯。在nt403和nt811間的一段較小EMCV區域，其內核糖體進入位點已被測定足以引導充分的轉譯(Jang，S.K and Wimmer，E.(1990)Genes Development 4，1560-1572)。後來的研究已經啟示EMCV-IRES屬於一組稱為類型IIIRES因子。上述類型IIIRES因子被認為是在AUG密碼的起始位點上直接連接核糖體的。EMCV-IRES在細胞體(in vitro)外，以及在各類不同的細胞類型中，當在沒有任何病毒編碼蛋白情況下，能充分起作用。因為這種重要特點，它在生物技術工業中已被廣泛利用來製造基因治療和異源基因表達的載體。這些載體能夠從一簡單的mRNA(Kleiman，S.E.，Pastan，I.，Puck，J.M and gottesman，M.M.(1998)Gene Therapy 5，671-676)中共譯二個或多個編碼序列。通常情況下在這些雙順反子和三順反子的連接中，第二或第三基因的表達比第一基因表達的效率較低(低2到15倍)，然而，由EMCV-IRES片段所驅使的第二和第三基因的表達都是相近的(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry 37，51-59)。由於第一基因的轉譯被設計成是由帽型掃描機制驅使，這些結果表明了EMCV-IRES導致了一個比常規帽形掃描模型效率較低的轉譯。這種較低的轉譯效率在某些等量的二種或多種蛋白須要同時表達的應用中可能很不理想。例如，表達一個受體的二個當量亞基或一個抗體的重鏈和輕鏈時即如此。
本發明的目的是提供一組經突變修飾的EMCV的IRES(EMCV-mIRES)，使用mIRES連接的串聯基因可以等量相關的表達，也即可以使第二或第三基因的表達增強。
本發明的目的是提供一種包含上述EMCV-IRES突變子的表達載體。
本發明的目的是提供一種用包含EMCV-IRES突變子的表達載體轉染的宿主細胞。
本發明目的是提供上述的任一種EMCV-IRES突變子在引導多個編碼基因在真核細胞中相關表達的應用；在製備基因治療相關試劑中的應用；蛋白表達在線監測中的應用。
本發明中的「相關表達」指二個或多個基因在真核細胞內通過雙順反子或多順反子轉錄物的共表達，下遊基因的表達與上遊有相互關係。
為了增強EMCV-IRES在多順反子連接中的轉譯功效，本發明引進了一系列單一的莖-環結構，對原始IRES的3′-末端上進行修改。原始EMCV-IRES的3』-末端結構顯示出一個富於-嘧啶的序列和在富於-嘧啶序列與第二基因轉譯起始之間的空間距離的特徵。雖然保守的富嘧啶序列被表明對有效的轉譯是極重要的，在它和AUG間的序列在不同的心病毒種屬及其菌株中而言並不是高度保守的，進一步說，該序列的二級結構(Sachs，A.B.，Sarnow，P andHetze，M.W.(1997)Cell 89，831-838)反而可能對IRES的轉譯效率較重要。因此，在空間距離中引進一個莖-環結構來突變EMCV-IRES聽來很具合理性。對莖-環結構，我們利用在體外選用的RNAaptamer序列，尤其是一個妥布拉黴素aptamer(Patel，d.，Suri，A.K.，Jiang，F.，Jiang，L，Fan，P.，Kumar，R.A.and Nonin，S.(1997)J.Mol.Biol.272，645-664)，這些序列簡短適當，而且它已被很好研究。在保留相似莖-環結構的前提下，設計了一系列突變，包括莖長、序列等因素的改變。在EMCV-IRES 3』末端上引進莖-環結構在功能上可分為二類，一類增強了下遊eGFP的表達(例如mIRES0，mIRES3，圖2)；而另一類則減低了表達(如mIRES4，圖2)。比較這些結果是很有趣的，我們注意到單一的莖-環結構，當它代替了處於富嘧啶和轉譯起始間的原始序列，能夠提高下遊eGFP的表達(圖3B和C)。而且這種能力很少受到小序列變化的影響，這些變化只要不影響莖-環結構(見圖2)。但是如果序列過長也會影響到增強子的轉移效率(Jang，S.K and Wimmer，E.(1990)Genes Development 4，1560-1572)。這顯然是真的，即使對第二基因的KOZAK序列進行改變(如mIRES3)，這種提高下遊表達的能力還是很少受影響。由此表明IRES引導的轉譯可能獨立於KOZAK原理。然而，當這種二級結構受到修改，如刪除一個在環上的核苷酸，並略為增加莖的長度(圖2，mIRES4)，其效應在GFP表達(圖3D)上，呈現相反的激烈減縮。這些結果表明了引進mIRES0，mIRES3莖-環結構在增強轉譯效應上起著重要作用。
本發明優選了二種典型的有利突變的莖-環結構mIRES0、mIRES3。
EMCV-mIRES突變修飾產生的方法。這些變更是靠PCR亞克隆化完成的。一個PCR正向引物，CCT CTG GAA GCT TCT TGAAGA被合成，它跨越EMCV-IRES的中心區域，並擁有一個原始的HindIII位點(在引物中部以斜體字顯示)。一組反向引物被設計在近IRES的3』末端，包括在其中部的莖-環結構和在引物5』末端的一個Ncol位點。然後完成的PCR反應產生HindIII-Ncol IRES，它們帶有在3』末端上(
圖1，圖2)突變結構的片段。這些PCR片段和一個蛋白編碼序列eGFP的Ncol-Xhol片段，eGFP是從peGFP-C1(Clontech，Palo Alto，.CA)來的，靠標準重組技術，被插入載體pCep4-eBFP-IRES-eGFP中。構建了含EMCV-mIRES的表達載體，如pCep4-eBFP-mIRES0-eGFP，pCep4-eBFP-mIRES3-eGFP。
上述含EMCV-mIRES的表達載體在轉染細胞時，採用本領域的常規技術進行。如可用脂質體方法把DNA轉進細胞內(LifeTech.試劑盒)。
EMCV-mIRES篩選的方法等。採用兩個不同的綠色螢光蛋白作為第一、第二編碼序列，用mIRES連接，在活的哺乳細胞中表達，選擇可導致各螢光蛋白等量相關表達的EMCV-mIRES結構，即為所需。綠色螢光蛋白可以是BFP、CFP、GFP、YFP。eBFP和eGFP二者的表達已被先前發表的液相流動細胞計量術(FCM)的檢測方法所測定和計量(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry 37，51-59)。
流動細胞計量術(FCM)。簡言之，表達載體轉染293細胞。在轉染48到72小時後，細胞用一種FACS Vantage TM(Becton-Dickinson，San Jose，CA)流動細胞計數器來分析。用二個Innova305(Coherent Laser Group相干雷射公司，Santa Clara，CA)多線Ar雷射器撥置到360-nm和488-nm上而產生激發波長。過濾探測構型對FLI/FL2光徑使用一個525-nm短路二色鏡，而對FLI(eGFP螢光)探測器則採用一個510/20的通帶濾器。對eBFP的蘭色螢光靠用一個在FL4探測器中的405/20通帶濾器而測得。過濾器購自Omega Optical光學公司(Brattleboro，VT)。正向和側散射被用來設置一個收集通道，死亡的細胞及廢渣因此可通過此通道而除去。在GFP和BFP螢光間未見光譜重疊，因此在實驗中不需補償。對每個實驗使用了一覽明細的公式來收集一萬到五萬次。用CellQuestTM v.3.0在蘋果Apple Power MacIntosh G3計算機上獲得並分析了數據。
流動細胞計量術可分析多順反子，多基因構建在真核細胞內的表達，例如，四個雙串連eGFP和eBFP的構建，即原始的IRES和IRES的三個修改物，mIRES0，mIRES3和mIRES4的表達分析。圖3展示了四個被完成實驗之一的代表數據。原始的IRES結構(圖3A)展示了相當多的轉染細胞種群，在第一和第三對數值間測到胞內螢光，並測到了共表達的eGFP(FL1)和eBFP(FL4)。我們觀察到在共表達細胞中，GFP和BFP強度之間有一個直接的相互關係。靠修改IRES，我們觀察到了GFP強度的重要的改變。這種改變來自於雙串連結構轉染的293細胞中。例如，mIRES0的修改導致GFP的強度上移了(圖3B)0.5-1.0的對數值。mIRES3的修改相對於原始的IRES而言，也導致相似的增強(圖3C)。然後使用mIRES4的修改(圖3D)我們也觀察到了有害的效果，GFP的強度被嚴重地減弱了。
四個各別的轉染實驗是對不同增殖年令數的293細胞進行的。在每個實驗中，右上方種群(quadrant population)，亦即GFP和BFP共表達的細胞種群被測定了。表1以MFI’s的平均值總結了從四個各別轉染來的結果。作為比較對照，GFP(MF1＝1645)或BFP(MF1＝39)的單一構造結果也被提供了。對一個親體的雙重構造(peBFP-IRES-eGFP)，其GFP的MFI平均值的比單一構造低二、三倍(729比1645)，而其BFP的MFI平均值則不太受影響，它證實了一個較弱IRES-驅使的表達。為了增加表達水平，使用了一個哺乳類附加型的載體(pCep4)，來帶有相同親體的雙重連接，即pCep4-eBFP-IRES-eGFP。與peBFP-IRES-eGFP構造比較，GFP和BFP二者的MFI在附加型的載體中都顯示了略高的水平。mIRES0和mIRES3的修改顯示了GFP胞內的螢光平均值比其親體IRES來得高(分別為3506和2717)。另一方面，mIRES4與其親體IRES比較而言，其GFP胞內螢光平均值(157)是極其弱的。在mIRES0和mIRES3中，來自位於IRES 5』的BFP表達所引發的螢光和在原始IRES中的BFP螢光顯現相似。它表明了此修改對上遊基因表達的影響甚小，而對其下遊eGFP表達的增強並非以犧牲上遊基因作為代價的。用螢光顯微鏡觀察，這些結果是一貫的。
表1 通過FCM測量帽形-和IRES-驅使的GFP表達GFP Constructs Blue MFI Green MFIpeBFP-N1 39peGFP-N1 1645pIRES-eGFP11 167peBFP-IRES-eGFP 61 729pCep4-eBFP-IRES-eGFP 83 1205pCep4-eBFP-m IRES0-eGFP 94 3506pCep4-eBFP-m IRES3-eGFP 77 2717pCep4-eBFP-m IRES4-eGFP 183 157表中peBFP-N1，peGFP-N1來自Clontech，第3至第5個質粒來源(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry 37，51-59)。
另外。為證實從修改過的IRES來的mRNAs的完整性，作了Northen印跡法的分析(圖4)。正如預期的那樣，用不同修改過的IRES構造(9-13電泳泳道)以及原始IRES構造(第6和第8泳道)轉染的細胞展示出一個長度類似的mRNA條帶，其長度約為2.6千鹼基(圖4)。這些結果表明IRES 3』末端的修改並未改變轉錄物的大小，而eBFP和eGFP的表達極可能是來自被各種IRES片段所連接的雙順反子轉錄物。因此其轉譯功效有了顯著的提高，這已通過檢測IRES下遊的螢光蛋白的表達水平有所證實。
綜上所述，本發明的EMCV-mIRES可以使多個編碼基因在1比1當量水平表達。如果將需要表達的蛋白基因代替螢光蛋白基因，則可廣泛應用於遺傳工程領域。
EMCV-IRES突變子可用於引導多個編碼基因在真核細胞中相關表達的應用。本發明所述的EMCV增強IRES能使其連接的上遊和下遊基因表達水平相當接近，而非象原始的IRES其下遊的基因表達比上遊基因表達要低十多倍。這一特點能使一個複合蛋白的兩個亞基的表達相當，減少由於兩個亞基表達的水平不一樣而可能導致的有害作用。例如有文獻報導當抗體的重鏈和輕鍊表達不平衡時，重鏈多而輕鏈少，累積的重鏈就會對細胞造成毒性。另一個優點是兩個亞基的相當表達可以減少浪費，不會使任一亞基累積無用。具體方法是參照上述EMCV-mIRES引入的方法，將eBFB和eGFP編碼序列用目的蛋白的編碼序列替代，按標準重組技術裝入載體，轉染相應細胞，在表達目的蛋白的條件下培養細胞，獲得產物。
EMCV-IRES突變子在製備基因治療相關試劑中的應用。例如將EMCV-mIRES及其連接的基因引入用於基因治療的載體中，再採用本領域常規的基因治療技術進行。Kleiman，S.E.，Pastan，I.，Puck，J.M.and Gottesman，M.M.(1998)Gene Therapy 5，671-676.；Zhou，Y.，Aran，J.，Gottesman，M.M.and Pastan，I.(1998)Human Gene Therapy 9，287-293.。
EMCV-IRES突變子在蛋白表達在線監測中的應用。尤其在藥用蛋白和工業用蛋白生產中。當用它把藥用蛋白和螢光蛋白(GFP)聯起來(通過重組技術)即能以1比1的比例把兩種蛋白的關係如實的相關起來。測定GFP是極其簡便，快速而且不會影響到動物細胞的正常生理狀態(Gilbert，P.A.，Garnier，A.，Jacob，D.AndKamen，A.(2000))。因此藥用蛋白的生產工藝流程也可得到在線監測，及時報告生產狀況。也可以使目前的工藝篩選跟蹤縮短十倍的時間，成本降低十到一千倍。這種方法本身已經用於數種藥用蛋白的生產而得到證實。
本發明優點在於EMCV-IRES突變子的轉譯效率能夠增加到象帽形轉譯水平那樣的相同水平，而其第一和第二順反子的表達以線形形式而相互關聯。
下面結合附圖和具體實施例來進一步闡述。
圖1.用莖-環結構引起EMCV-IRES 3』-末端修改的策略。
圖2.在mIRES 3』-末端上的具有代表性的莖-環序列。在下遊eGFP的AUG上的Ncol點下面已被劃線。
圖3.增強的IRES元素的FACS分析。
圖4.各種單順反子和雙順反子GFP轉錄物的Northen印跡法分析。
泳道1，無DNA；2，peBFP-N1；3，peGFP-N1 4，peYFP-N1；5，pIRES-eGFP；6，peBFP-IRES-eGFP；7，pCep4-eGFP；8，pCep4-eBFP-IRES-eGFP；9，pCep4-eBFP-mIRES0-eGFP；10，pCep4-eBFP-mIRES 1-eGFP；11，pCep4-eBFP-mIRES2-eGFP；12，pCep4-eBFP-mIRES3-eGFP；13，pCep4-eBFP-mIRES4-eGFP；14，pCep4-eBFP-IRES-eGFP-IRES-eYFP。
實施例1 EMCV-IRES 3′末端上的突變方法這些變更是靠PCR亞克隆化完成的。引物合成一個PCR正向引物，CCT CTG GAA GCT TCT TGA AGA被合成，它跨越EMCV-IRES的中心區域，並擁有一個原始的HindIII位點(在引物中部以斜體字顯示)。
一組反向引物被設計在近IRES的3』末端，包括在其中部的髮夾結構和在引物5』末端的一個Ncol位點以及在3』末端的富嘧啶序列。PCR反應靠標準技術(Perkin-Elmer Corp，Foster City，CA)。
產生HindIII-Ncol IRES，它們帶有在3』末端上(
圖1，圖2)突變結構的片段。這些PCR片段和一個編碼eGFP的Ncol-Xhol片段，它從peGFP-C1(Clontech，Palo Alto，CA)來的，靠標準重組技術(《分子克隆實驗指南》(第二版))，被插入pCep4-eBFP-IRES-eGFP載體中(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry37，51-59)。
實施例2 增強的IRES元素的細胞轉染和FACS分析。
mIRES表達載體轉染人的293細胞。轉染技術用脂質體方法把DNA轉進細胞內(Life Tech.試劑盒)。在轉染培養48到72小時後細胞被收穫。採用前述所設置的濾器和檢測器對同時發生的蘭色(FL4，eBFP)和綠色(FL1，eGFP)螢光發射進行分析。雙重激發的Ar-雷射線(360-nm和488-nm)被使用了(見圖3)。
在四個各別實驗中按不同的實驗日期，用不同增殖年齡數的細胞，人的293細胞被8個不同的單一基因或雙重串聯基因構造而分別轉染。根據模擬轉染對照來劃分四個散型區域。平均螢光強度[MFls]是從有效區域內的細胞點數來測定。通過n＝4實驗，取得MFIs的平均值。所得的平均數據的方差係數少於40％。實驗結果見表1。
實施例3 各種單順反子和雙順反子GFP轉錄物的Northern印跡法分析293細胞是用下列質粒來轉染，2，peBFP-N1；3，peGFP-N1 4，peYFP-N1；5，pIRES-eGFP；6，peBFP-IRES-eGFP；7，pCep4-eGFP；8，pCep4-eBFP-IRES-eGFP；9，pCep4-eBFP-mIRES0-eGFP；10，pCep4-eBFP-mIRES1-eGFP；11，pCep4-eBFP-mIRES2-eGFP；12，pCep4-eBFP-mIRES3-eGFP；13，pCep4-eBFP-mIRES4-eGFP；14，pCep4-eBFP-IRES-eGFP-IRES-eYFP。並使用Northern印跡法進行分析。質粒2-4購自Clontech公司，其餘質粒按(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry 37，51-59)構建或按實施例1構造。在轉染培養48到72小時後細胞被收穫。總的RNA樣品都從293細胞中提取。具體方法按照《分子克隆實驗指南》(第二版)。
權利要求
1.一組腦心肌炎病毒的增強轉譯因子(EMCV-IRES)突變子，其特徵在於EMCV-IRES的3′-末端的結構改變。
2.根據權利要求1所述的EMCV-IRES突變子，其特徵在於EMCV-IRES的3′-末端引入一個莖-環結構。
3.根據權利要求2所述的EMCV-IRES突變子，莖-環由下述序列之一形成(1)GAG-GUUUAGCUACACUA(2)UAG-GUUUAGCUACGCU
4.包含權利要求1、2或3所述EMCV-IRES突變子的表達載體。
5.一種用包含1、2或3所述的EMCV-IRES突變子的表達載體轉染的宿主細胞。
6.權利要求1、2或3的任一種EMCV-IRES突變子用於引導多個編碼基因在真核細胞中相關表達的應用。
7.權利要求1、2或3的任一種EMCV-IRES突變子在製備基因治療相關試劑中的應用。
8.權利要求1、2或3的任一種EMCV-IRES突變子在蛋白表達在線監測中的應用。
全文摘要
一種增強內轉譯因子及其用途。在腦心肌炎病毒增強轉譯因子(EMCV－IRES)的3′末端引入莖－環結構的修飾,新的增強轉譯因子可以使連接的串聯基因等量相關表達。本發明同時提供該類EMCV－IRES突變子在引導多個編碼基因在真核細胞中相關表達的應用;在製備基因治療相關試劑中的應用;蛋白表達在線監測中的應用。還提供了含EMCV－IRES突變子的表達載體及宿主細胞。
文檔編號C12N15/63GK1361131SQ0013720
公開日2002年7月31日 申請日期2000年12月28日 優先權日2000年12月28日
發明者祝敬東, 祝新華 申請人:上海鴻和工貿發展有限公司, 上海星曄國際貿易有限公司