一種染色體異常核型質控細胞庫及其構建方法
2023-06-05 06:10:46
一種染色體異常核型質控細胞庫及其構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種用於醫療領域的染色體異常核型質控細胞庫及其構建方法，其主要特徵是取自因臨床診治需要而作常規染色體病診斷後並已確診為疑難染色體異常的剩餘的呈貼壁生長的活細胞，經反覆傳代、大量擴增細胞後，收穫細胞，作低滲、固定、懸浮於固定液、-20℃貯存，然後提取數例各自製備的貯存細胞，按質控要求的比例混合，由此製成的質控細胞數量多且具有在同一份質控細胞中同時含有多種不同比例和類型的易誤診染色體異常核型的特徵，增加了鑑別診斷、染色體嵌合體診斷的難度和複雜性，標本易得且將廢棄的多餘細胞轉化為質控細胞，用於室間質評、室內質控和技術考核，對及時發現誤診問題、提高診斷水平具有顯著的效果。
【專利說明】一種染色體異常核型質控細胞庫及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種染色體異常核型質控細胞庫及其構建方法，主要應用於醫學領域 的細胞遺傳學診斷實驗室作染色體核型分析的技術考核、室內質控和室間質評。
【背景技術】
[0002] 染色體是細胞核中的遺傳物質，人類有23對染色體，其中22對為常染色體，1對為 決定男女性別的性染色體。染色體上載有遺傳信息的基因，其中DNA佔90%以上，RNA含量 隨細胞周期及生長情況而有所變化，一般佔1%?10%。
[0003] 染色體結構異常、數目異常及嵌合體，臨床上表現為染色體病，屬於常見的出生缺 陷，如先天愚型、原發性閉經、兩性畸型等。染色體結構異常包括染色體易位、缺失、倒位、環 狀等；染色體數目異常指多1條或數條染色體、多1條或數條染色體片段；嵌合體核型是指 同一病例個體並存數種染色體核型。目前分析染色體核型的常規方法是用被檢的組織或 細胞，經過常規細胞培養、0. 02 μ Ι/ml秋水仙素終止細胞生長、分離中期細胞、0. 075mol/L KC1低滲、甲醇-冰乙酸（3 : 1)固定等染色體製片程序後，最後用胰酶消化、染色顯帶，從 而作出染色體結構和數目是否異常的判斷。目前通過染色體分析來診斷染色體病已被各級 產前診斷中心或醫院檢驗科普遍地開展，並廣泛應用於產前、胚胎植入前染色體病的診斷 以及作為異常妊娠、血液病、腫瘤等臨床診斷或發病機理研究的重要指標。
[0004] 作為所開展的各類實驗診斷項目，均應有相應規範的質量控制措施。實驗室的質 量控制是確保實驗診斷結果準確性的前提，已成為政府行為。為了加強實驗室的質量控制， 我國於1982年成立了衛生部臨床檢驗中心，下設室間質評辦公室，專職從事於實驗診斷項 目的質量控制。衛生部[衛醫發]1997第31號文件、《臨床實驗室管理辦法》、《醫院評審標 準實施細則》以及大量的文獻均指出，實驗室必須有規範的質量控制標準，所開展的實驗診 斷項目必須參加衛生部臨床檢驗中心組織的室間質評。自1982年以來，在臨床檢驗學科先 後開展了臨床實驗的室內質控、室間質評。包括了對各檢驗項目的實驗前、中、後以及儀器、 試劑和實驗人員的質量控制。質量控制已滲透到臨檢、生化、微生物、免疫、基因、細胞形態 學診斷等各個實驗項目。實驗室的質量控制已成為開展實驗診斷項目的準入制度、成為醫 院等級評審的重要標準。
[0005] 產前診斷的質量控制已引起日益重視。隨著我國對生殖健康和出生缺陷工作的 是益重視，近年來各省市均建立了產前診斷中心，開展了 21三體綜合症、18三體症候群、 神經管畸形等重大出生缺陷的產前篩查和產前診斷，其中與重大出生缺陷相關的胎兒羊水 染色體異常的診斷已成為目前產前診斷的主要項目。由於產前診斷是新開展的學科，大多 專業人員的技術經驗較為缺乏，特別是對於疑難、罕見病例、國內外首報病例以及如貓叫綜 合症等染色體異常不明顯但臨床後果嚴重的病例，誤診現象時有發生。我國國家主席令 (1994年10月27日第三十三號）公布的"產前診斷法規標準"以及國務院辦公廳[國發辦 (1999) 15號]轉發衛生部"關於做好提高出生人口素質工作意見"的通知中均強調指出， "各省、市產前診斷中心必須加強產前診斷的質量控制、嚴把質量關"。
[0006] 產前診斷的質量控制是許多學者致力於研究的重要課題。國外有較多的文獻報 道了產前診斷質量控制的重要性，Sikkema-Raddatz B等對產前細胞遺傳學診斷的細胞培 養及製片過程的影響因素作了深入的研究，提出了室內質量控制的方法；Fries N和Merz E等提出了影像學產前診斷的質量控制方法；Pihlk等認為必須加強產前篩查的質量控制； 在2002?2004年期間，Bastien P等對法國23家實驗室作了弓形蟲產前分子診斷的室間 質量評價，認為室間質評對促進實驗室間的技術交流、發現問題、提高實驗診斷質量起到重 要的作用。
[0007] 研製可行的質控物，是開展產前細胞遺傳學診斷室間質評和室內質控的關鍵環 節。雖然我國行政主管部門以及學術界十分重視產前診斷的質量控制（包括室內質控和室 間質評），但因沒有可行的質控物，所以無法開展實質性的質量控制。也就是說，要開展產前 細胞遺傳學診斷的室間質評，首先必須要有質控物。這是質量管理人員以及本專業的技術 人員長期以來想方設法解決但始終沒有解決的難題。
【發明內容】
[0008] 為了解決在產前細胞遺傳學診斷中無質控物的問題，本發明人提出了本發明。
[0009] 本發明的目的是要提供一種應用於醫學領域的細胞遺傳學診斷實驗室作染色體 核型分析的技術考核、室內質控和室間質評的染色體異常核型質控細胞庫及其構建方法。 [0010] 本發明的目的是這樣實現的：取自因臨床診治需要而作常規染色體病實驗診斷後 並已確診為疑難、罕見染色體異常的剩餘的呈貼壁生長的原代或傳代活細胞，經反覆傳代、 大量擴增細胞數量後，或邊傳代擴增邊收穫貼壁細胞，經低滲和固定後，將細胞懸浮於3份 甲醇和1份冰乙酸配製的固定液中，作為原液質控細胞貯存於-20°C備用，然後根據待制 作的質控細胞的要求，提取數例各自製備的不同病例的疑難染色體異常的原液質控細胞， 按所需要的比例混合使之成為應用質控細胞，從而使原先一般每份只有一種染色體異常核 型的原液質控細胞轉變為含有不同比例的、易於誤診的多種染色體異常核型的應用質控細 胞，繼續保存於_20°C的固定液中，備作染色體核型分析的質量控制之用。
[0011] 本發明取自因臨床診治需要而作常規染色體病實驗診斷後並已確診為疑難、罕見 染色體異常的剩餘的呈貼壁生長的原代或傳代活細胞，經反覆傳代、大量擴增細胞數量後 收穫貼壁細胞，製備原液質控細胞，然後將各自製備的不同例次的原液質控細胞按質控需 要比例混合，使之成為應用質控細胞，所製備的質控細胞不但數量足夠的多，而且使原先一 般每份原液質控細胞中只有一種染色體異常核型轉變為具有在同一份應用質控細胞中同 時含有多種不同比例的、不同類型的易誤診染色體異常核型的特徵，從而在本來就易誤診 的基礎上更加增加了鑑別診斷、染色體嵌合體診斷的難度和複雜性，標本易得且將廢棄的 多餘細胞轉化為可用於染色體核型分析的技術考核、室內質控及室間質評，在室內質量控 制、室間質量評價、提高診斷水平的應用中具有意想不到的效果。
【具體實施方式】
[0012] 1、常規標本採集與培養：按常規取因臨床診治或產前診斷需要而作常規染色體病 實驗診斷的胎兒羊水、絨毛組織等標本，按常規處理標本，將細胞接種於25cm2細胞培養瓶 中，每例接種2?3瓶，加 RPMI-1640細胞培養液3ml，37°C、5% C02中培養，羊水細胞培養 7天左右換液，上層液倒入另一培養瓶中，加入新鮮培養液3ml，繼續培養至細胞匯合率達 85%左右；絨毛組織接種後第2天顯微鏡下觀察生長情況，有梭形細胞生長時換新鮮培養 液，繼續培養至細胞匯合率達85 %左右。
[0013] 2、常規細胞收穫與染色體製備：（1)終止培養前2?3h，加入濃度為20 μ g/ml的 秋水仙素，每5ml培養基中用7號針頭，加3?4滴使最終濃度為0. 1 μ g/ml。輕輕搖勻 後，再放入恆溫箱內，繼續培養2?3h，以積累較多停止在中期的分裂象。（2)收穫細胞：由 恆溫箱取出培養瓶，以〇. 25%胰蛋白酶消化貼壁細胞5分鐘，每次收穫1瓶，用吸管充分吹 打培養瓶瓶壁，使細胞全部脫離瓶壁，然後將細胞液移至錐形離心管內，1500轉/min，離心 lOmin，去上清液。（3)低滲處理：加入37°C預溫的0· 075mol/L KC18ml，反覆吹打（約一百 次）後，置37°C水浴箱中低滲處理25min左右。（4)預固定：加入新鮮製備固定液lml (甲 醇：冰醋酸=3 : 1)，輕輕混勻。（5)離心：2000轉/min,離心lOmin，吸棄上清液。（6)固 定：沿離心管壁慢慢加入固定液8ml，輕輕混勻，固定lOmin。（7)離心：同上，吸去上清液。 (8)再固定：力_定液8ml，混勻，固定lOmin。（9)離心：同上，吸去上清液。（10)制細胞懸 液：根據細胞量多少，加入適量固定液，充分混勻，製成細胞懸液，保存備用。
[0014] 3、常規製片與顯帶：（1)滴片：取出預先經冰水浸泡的載玻片，用吸管吸取混勻的 細胞懸液在離冰片約30cm距離進行滴片，每片約滴2?3滴細胞懸液，使細胞較好分散。一 般每一培養瓶可制3?5張標本片。（2)染色：標本涼幹後，即可用染液（Giemsa液原液1 份，ρΗ6· 8的磷酸緩衝液9份）染色15min，自來水衝洗後（從背面衝洗）晾乾備用。
[0015] 4、常規染色體核型分析：以 Automated Cytogenetics Platform Cytovision(Leica Microsystems)攝下良好的分裂相作染色體結構分析，作出確診。除 了自動分析以外，染色體核型分析還可以在光學顯微鏡下計數30個染色體核型，以發現染 色體數目是否異常，如有嵌合體等特殊情況，計數至100個染色體核型；在油鏡下分析3-5 個染色體核型，以發現有無染色體易位、缺失、倒位、環狀等各類結構異常，最後作出診斷報 生 1=1 〇
[0016] 5、質控細胞製備前的擴增培養：將已經上述方法確診為疑難、罕見染色體異常病 例的剩餘的呈貼壁生長的原代或傳代活細胞，每7天左右更換適量的新鮮培養液，繼續培 養至細胞匯合率達85%左右，以0. 25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，以無菌生理鹽水洗淨胰蛋 白酶，加適量培養基混懸細胞，轉入數個較大的培養瓶再次繼續傳代培養，如此反覆，傳代 至50?100代或更多，直至細胞大量擴增後，作細胞收穫與染色體製備，或在傳代過程中邊 傳代邊收穫適量的傳代細胞。
[0017] 6、原液質控細胞的製備：在"常規細胞收穫與染色體製備"的基礎上製備原液質控 細胞，即：（1)終止培養、收穫細胞前2?3h，加入濃度為2〇μ8/πι1的秋水仙素，每5ml培養 基中用7號針頭，加3?4滴使最終濃度為0. 1 μ g/ml。輕輕搖勻後，再放入恆溫箱內，繼 續培養2?3h，以積累較多停止在中期的分裂象。（2)收穫細胞：由恆溫箱取出培養瓶，以 0. 25%胰蛋白酶消化貼壁細胞5分鐘，每次收穫1瓶，用吸管充分吹打培養瓶瓶壁，使細胞 全部脫離瓶壁，然後將細胞液移至錐形離心管內，1500轉/min，離心10min，去上清液。（3) 低滲處理：加入37°C預溫的0· 075mol/L KC18ml，反覆吹打（約一百次）後，置37°C水浴箱 中低滲處理25min左右。（4)預固定：加入新鮮製備固定液lml (甲醇：冰醋酸=3 : 1)， 輕輕混勻。（5)離心：2000轉/min，離心10min，吸棄上清液。（6)固定：沿離心管壁慢慢加 入固定液8ml，輕輕混勻，固定lOmin。（7)離心：同上，吸去上清液。（8)再固定：加固定液 8ml，混勻，固定lOmin。（9)離心：同上，吸去上清液。（10)製備原液質控細胞懸液：根據細 胞量多少，加入適量固定液，充分混勻，製成濃度為l〇 5/ml的細胞懸液，保存備用。
[0018] 7、應用質控細胞的製備：提取數例在不同時間製備的不同病例的疑難染色體異常 核型的原液質控細胞，按1例原液質控細胞懸液分別與另外1例、2例、3例、4例、5例、6例、 7例、8例、9例、10例、11例、12例、14例、15例、16例、17例、18例、19例、20例、1?50例原 液質控細胞懸液以 1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、 1 : 1?20的體積比例或細胞數比例進行混合，混合後的應用質控細胞懸液含有不同類型 和比例的染色體異常細胞，但作為同一例次的質控細胞。如此經傳代擴增細胞、收穫細胞、 混合不同病例的染色體異常細胞所製備的質控細胞，不但數量足夠的多，而且使原先一般 每份原液質控細胞中只有一種染色體異常核型轉變為具有在同一份應用質控細胞中同時 含有多種不同比例的、不同類型的易誤診染色體異常核型的特徵，從而在本來就易誤診的 基礎上更加增加了鑑別診斷、染色體嵌合體診斷的難度和複雜性，標本易得且將廢棄的多 餘細胞轉化為可用於染色體核型分析的技術考核、室內質控及室間質評，在室內質量控制、 室間質量評價、提高診斷水平的應用中具有意想不到的效果。
[0019] 8、質控細胞庫的建立：將上述在不同時間製備的應用質控細胞以（甲醇：冰醋酸 =3 : 1的）固定液配成濃度為105/ml的細胞懸液，經分裝、加滿固定液至管口和封口後， 按年、月、日的製備日期及標本來源地址的大寫英文字母編號，集中保存於_20°C，備作染色 體核型分析的質量控制之用。同時將相應的各種染色體異常核型的標準描述、按照年、月、 日的製備日期以及標本來源地址的大寫英文字母編號錄入計算機管理系統，使用時從計算 機中抽取待用質控細胞編號，然後從質控細胞庫中找出相應的質控細胞作質量評價。
[0020] 9、室間質評中的應用：從計算機中抽取待用質控細胞編號，然後從質控細胞庫中 找出相應的質控細胞，發送到各實驗室或相關專業技術人員，在收到質控細胞後，各室按常 規作染色體製片、烤片乾燥、胰蛋白酶消化分帶、染色G顯帶、常規染色體核型分析、按時反 饋染色體核型診斷結果，組織者或考核者評價各受試對象所匯總的診斷結果的準確性、誤 診情況，分析原因、定期討論、改正存在問題，以增加技術人員的見識和經驗，提高診斷質 量。也可取質控細胞送交被考核者，作染色體製備和核型分析後，以書面、口頭、當場考核被 考核者診斷技術水平。
[0021] 10、室間質評調查實例：我們按上述方法自制了 1個組合單位的染色體異常質控 細胞並建立了質控細胞庫，每個組合單位含有6種染色體異常核型，其核型分別為46, X， t(Y ;5) (ql2 ;q21)、46, ΧΥ，15P+、46, XX，t(13 ;18) (ql2 ;q21)、46, X，r(Xp)、46, X，t(Y ;Y) 和46, XX，t(9 ;20) (P13 ;pl3)，均屬較為疑難、罕見的異常核型，並作了細胞遺傳學診斷的 室間質評試驗。我們向35個實驗室各發放了 1個組合單位的染色體異常質控細胞，共計 35個組合單位，各受試者作染色體核型分析後所回報的結果，相對應於46, X，t (Y ;5) (ql2 ; q21)、46, XY，15P+、46, XX，t(13 ;18) (ql2 ;q21)、46, X，r(Xp)、46, X，t(Y ;Y)和 46, XX，t(9 ; 20) (P13 ;pl3)的6種染色體異常核型排序的結果，其完全正確率分別為81. 82%、78. 13%、 86. 67 %、78· 79 %、78· 13 %、90· 32 %，完全錯誤率分別為 15. 15 %、21· 88 %、10· 00 %、 18. 18%、21.88%、6.45%，總的完全正確率、部分正確率、部分錯誤率和完全錯誤率分別為 82. 20%、0. 52%、1. 57%和15. 71%。表明各受試者的細胞遺傳學診斷結果存在較高的誤
【權利要求】
1. 一種用於醫療領域的染色體異常核型質控細胞庫及其構建方法，其主要特徵是取自 因臨床診治需要而作常規染色體病診斷後並已確診為疑難染色體異常的剩餘的呈貼壁生 長的活細胞，經反覆傳代、大量擴增細胞後，收穫細胞，作低滲、固定、懸浮於固定液、作為原 液質控細胞，-20°c貯存，然後提取數例各自製備的原液質控細胞，按質控要求的比例混合， 製成應用質控細胞，-20°C貯存備用，由此經傳代擴增細胞、收穫細胞、混合不同病例的染色 體異常細胞所製備的質控細胞，不但細胞數量足夠的多，而且使原先一般每份原液質控細 胞中只有一種染色體異常核型轉變為具有在同一份質控細胞中同時含有多種不同比例的、 不同類型的易誤診染色體異常核型的特徵，從而增加了鑑別診斷、染色體嵌合體診斷的難 度和複雜性，標本易得且將廢棄的多餘細胞轉化為可用於染色體核型分析的技術考核、室 內質控及室間質評的質控細胞，在室內質量控制、室間質量評價、提高診斷水平的應用中具 有意想不到的效果。
2. 根據權利要求1所述的一種用於醫療領域的染色體異常核型質控細胞庫及其構建 方法，其特徵是提取數例在不同時間製備的不同病例的疑難染色體異常核型的原液質控細 胞，按1例原液質控細胞懸液分別與另外1例、2例、3例、4例、5例、6例、7例、8例、9例、10 例、11例、12例、14例、15例、16例、17例、18例、19例、20例、1?50例原液質控細胞懸液 以1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 1 ?20 的體 積比例或細胞數比例進行混合，混合後的質控細胞懸液含有不同類型和比例的染色體異常 細胞，但作為同一例次的質控細胞。
3. 根據權利要求1所述的一種用於醫療領域的染色體異常核型質控細胞庫及其構建 方法，其特徵是將上述在不同時間製備的質控細胞以（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）固定液 配成濃度為l〇5/ml的細胞懸液，經分裝、加滿固定液至管口和封口後，按年、月、日的製備日 期及標本來源地址的大寫英文字母編號，集中保存於_2〇°C，建立質控細胞庫。
4. 根據權利要求1、3所述的一種用於醫療領域的染色體異常核型質控細胞庫及其構 建方法，其特徵在於，質控細胞庫包含 以固定液（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）為媒介的、-20°C保存的、按年、月、日的製備日 期及標本來源地址的大寫英文字母編號的原液質控細胞； 以固定液（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）為媒介的、-20°C保存的、按年、月、日的製備日 期及標本來源地址的大寫英文字母編號的、以固定液配成細胞濃度為l〇5/ml的應用質控細 胞； 與質控細胞相對應的各種染色體異常核型的標準描述、按照年、月、日的製備日期以及 標本來源地址的大寫英文字母編號錄入計算機管理系統，使用時從計算機中抽取待用質控 細胞編號，然後從質控細胞庫中找出相應的質控細胞作質量評價。
【文檔編號】C40B40/02GK104060328SQ201310109732
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月19日 優先權日:2013年3月19日
【發明者】翁炳煥 申請人:翁炳煥