一種對糖蛋白具有富集作用的溫度響應型核交聯星型聚合物及其製備方法與流程
2023-06-05 17:45:11
本發明涉及一種對糖蛋白具有富集作用的溫度響應型核交聯星型聚合物及其製備方法，屬於材料科學和生物分離工程領域。
背景技術：
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糖蛋白是寡糖鏈通過共價鍵連接到蛋白上的一類重要的後翻譯蛋白。糖基化後的蛋白參與生命體中許多生理活動比如細胞的識別、信號的傳遞、免疫響應等。同時有大量的研究表明糖鏈結構的異常與許多疾病的發生有關，因此有些糖蛋白又可作為某些疾病的生物標誌。因而對糖蛋白結構的研究以及對異常糖蛋白的檢測有著重要的意義。然而對於實際的樣品而言，糖蛋白的低豐度，以及電離效率較低，因而很難通過生物質譜直接對生物樣品中糖蛋白進行有效的分析。因此對複雜的生物樣品分析之前有必要對糖蛋白有選擇的富集。然而目前製備對糖蛋白有富集作用的材料主要是在一些固相的納米材料(磁性的四氧化三鐵，介孔二氧化矽)上修飾與糖蛋白有相互作用的識別單元。一方面將識別單元固定在固體基質上的過程比較繁瑣，同時識別單元的固定量往往也較低，另一方面由於固液界面傳質困難使得該材料富集能力進一步較低，同時也延長了孵化時間，降低了工作效率。
智能型聚合物是指對外界刺激(溫度、pH值、溶劑、鹽濃度、電場以及化學物質)能產生敏感響應的一類高分子聚合物。其中聚(N-異丙基丙烯醯胺)(PNIPAm)是一種溫度響應型聚合物，當溫度高溫LCST(32℃)時，聚合物的構象會從無規線團轉變為蜷曲球(coil-to-globule)，從而使聚合物從水中析出。然而糖蛋白是生物大分子，分子量較高，且構象複雜，雖然在溫度響應型聚合物上引入識別單元可以實現糖蛋白的捕獲，但是就單個分子鏈而言很難將糖蛋白從混合溶液中分離出來。
傳統意義上的星型聚合物的中心核只是一個結點,中心核的尺寸和分子量在整個聚合物分子中所佔的比例可忽略不計,聚合物所表現出來的性質主要由線形支鏈決定。但如果中心核的尺寸達到納米級,聚合物的性質則將明顯受到納米核的制約,從而表現出與線形支鏈不一樣的特性。人們稱這種聚合物為核交聯星型聚合物(core Cross-linked star Polymer,CCS Polymer)。製備CCS聚合物的方法有兩種,一種是「臂優先」法,另一種是「核優先」法。CCS聚合物因結構上具有交聯內核和向核外空間伸展的聚合物外臂，而具有獨特的三維結構，在諸多領域有著重要的應用。
技術實現要素：
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本發明的目的是提供一種對糖蛋白具有富集作用的溫度響應型核交聯星型聚合物及其製備方法。通過「先臂後核」的途徑及RAFT聚合，製備出了對糖蛋白具有富集作用的溫度響應型核交聯星型聚合物。其中富集過程只需改變溶液的溫度便可實現。
為實現上述目的,本發明採用的技術方案為:
(1)核交聯星型聚合物PNSB@PAA-DMP的合成
將鏈轉移劑三硫代碳酸酯(DMP)、親水單體丙烯醯胺(AM)、識別單元、油溶性引發劑偶氮二異丁腈(AIBN)，按照1:(0～100):50:0.1摩爾比加入到水和二甲基甲醯胺(DMF)混合溶劑中，在惰性氣氛下，60～80℃反應12～24h，聚合結束後,對聚合物提純,得到能夠特異性捕獲糖蛋白的親水外臂(PAA-DMP)；將上述的親水外臂PAA-DMP作為大分子鏈轉移劑、溫敏單體、交聯劑、疏水單體苯乙烯(St)、引發劑AIBN，按照(50～200):(150～300):(5～20):(10～50):1質量比加到水和DMF混合溶劑中，在惰性氣氛下,60～80℃反應12～24h，聚合結束後,對聚合物提純,得到純淨的對糖蛋白具有富集作用的溫度響應型核交聯星型聚合物(PNSB@PAA-DMP)。
(2)糖蛋白的富集
取少量PNSB@PAA-DMP聚合物放到PH＝9的蛋白的混合溶液中，10℃孵化10min；將孵化之後的蛋白溶液加熱至35℃，保溫5min，這時可以看到有大量的沉澱析出；通過離心將絡合有糖蛋白的PNSB@PAA-DMP聚合物從混合溶液中分離出來；多次洗滌非特異性吸附之後，降低溶液的pH使星型聚合物將絡合的糖蛋白釋放，完成糖蛋白的富集。
與現有技術相比，本分明具有如下優點：
1)當溫度在LCST之下星型聚合物完全溶於水中，消除了固液界面所引起的物質傳遞困難，使得糖蛋白的富集時間縮短，富集容量提高；當溫度高於LCST，此時親水的交聯內核變為疏水的內核，絡合有糖蛋白的星型聚合物從溶液中析出，實現了糖蛋白的分離過程。
2)通過臂優先法固定識別單元方法相對簡單，且固定量高，同時所形成的三維的柔性外臂與糖基位點的協同作用，將會進一步增加吸附容量。
3)本發明所合成的溫度響應型核交聯星型聚合物為樣品中特定對象的選擇分離提供了一種有效的分離方法，因為只需要改變外臂上的識別單元，就可以實現核交聯星型聚合物對不同對象的特異性捕獲，然後再通過改變溫度，絡合有目標分子的溫度響應型聚合物便可以從混合溶液中析出，達到富集的目的。
附圖說明
圖1是本發明的對糖蛋白具有富集作用的溫度響應型核交聯星型聚合物的合成示意圖；
圖2是本發明的對糖蛋白具有富集作用的溫度響應型核交聯星型聚合物的核磁氫譜；
圖3是本發明的溫度響應型核交聯星型聚合物對辣根過氧化物酶(HRP)的富集容量。
具體實施方式：
實施例1
(1)核交聯星型聚合物PNSB@PAA-DMP的合成
鏈轉移劑三硫代碳酸酯(DMP)、親水單體丙烯醯胺(AM)、識別單元並醯胺基苯硼酸(AAPBA)、油溶性引發劑AIBN，按照1:100:50:0.1摩爾比加入到水和二甲基甲醯胺混合溶劑。在惰性氣氛下，70℃反應24h，聚合結束後，對聚合物提純,得到能夠特異性捕獲糖蛋白的親水外臂(PAA-DMP)。將上述的親水外臂PAA-DMP作為大分子鏈轉移劑、溫敏單體選用N-異丙基丙烯醯胺(NIPAM)、交聯劑選用N,N-亞甲基雙丙烯醯胺(Bis)、疏水單體苯乙烯(St)引發劑AIBN，按照50:282:7.8:25:1質量比加到水和二甲基甲醯胺混合溶劑中。在惰性氣氛下，70℃反應24h，聚合結束後，對聚合物提純,便得到純淨的對糖蛋白具有富集作用的溫度響應型核交聯星型聚合物PNSB@PAA-DMP。
(2)糖蛋白的富集
取少量PNSB@PAA-DMP聚合物放到PH＝9的蛋白的混合溶液中，10℃孵化10min；將孵化之後的蛋白溶液加熱至35℃，保溫5min，這時可以看到有大量的沉澱析出；通過離心將絡合有糖蛋白的PNSB@PAA-DMP從混合溶液中分離出來；多次洗滌非特異性吸附之後，降低溶液的PH使星型聚合物將絡合的糖蛋白釋放，完成糖蛋白的富集。
實施例2
(1)核交聯星型聚合物PNSB@PAA-DMP的合成
鏈轉移劑三硫代碳酸酯(DMP)、親水單體丙烯醯胺(AM)、識別單元乙烯基苯硼酸(APBA)、油溶性引發劑AIBN，按照1:100:50:0.1摩爾比加入到水和二甲基甲醯胺混合溶劑。在惰性氣氛下，70℃反應24h，聚合結束後，對聚合物提純，得到能夠特異性捕獲糖蛋白的親水外臂(PAA-DMP)。將上述的親水外臂PAA-DMP作為大分子鏈轉移劑、溫敏單體選用N-異丙基丙烯醯胺(NIPAM)、交聯劑選用N,N-亞甲基雙丙烯醯胺(Bis)、疏水單體苯乙烯(St)引發劑AIBN，按照50:282:7.8:25:1質量比加到水和二甲基甲醯胺混合溶劑中。在惰性氣氛下,70℃反應24h，聚合結束後，對聚合物提純,便得到純淨的對糖蛋白具有富集作用的溫度響應型核交聯星型聚合物PNSB@PAA-DMP。
(2)糖蛋白的富集
取少量PNSB@PAA-DMP聚合物放到pH＝9的蛋白的混合溶液中，10℃孵化10min；將孵化之後的蛋白溶液加熱至35℃，保溫5min，這時可以看到有大量的沉澱析出；通過離心將絡合有糖蛋白的PNSB@PAA-DMP從混合溶液中分離出來；多次洗滌非特異性吸附之後，降低溶液的PH使星型聚合物將絡合的糖蛋白釋放，完成糖蛋白的富集。
實施例3
(1)核交聯星型聚合物PNSB@PAA-DMP的合成
鏈轉移劑三硫代碳酸酯(DMP)、識別單元乙烯基苯硼酸(APBA)、油溶性引發劑AIBN，按照1:50:0.1摩爾比加入到水和二甲基甲醯胺混合溶劑。在惰性氣氛下，70℃反應24h，聚合結束後，對聚合物提純,得到能夠特異性捕獲糖蛋白的親水外臂(PAA-DMP)。將上述的親水外臂PAA-DMP作為大分子鏈轉移劑、溫敏單體選用N-異丙基丙烯醯胺(NIPAM)、交聯劑選用N,N-亞甲基雙丙烯醯胺(Bis)、疏水單體苯乙烯(St)引發劑AIBN，按照50:282:7.8:25:1質量比加到水和二甲基甲醯胺混合溶劑中。在惰性氣氛下，70℃反應24h，聚合結束後，對聚合物提純,便得到純淨的對糖蛋白具有富集作用的溫度響應型核交聯星型聚合物PNSB@PAA-DMP。
(2)糖蛋白的富集
取少量PNSB@PAA-DMP聚合物放到pH＝9的蛋白的混合溶液中，10℃孵化10min；將孵化之後的蛋白溶液加熱至35℃，保溫5min，這時可以看到有大量的沉澱析出；通過離心將絡合有糖蛋白的PNSB@PAA-DMP從混合溶液中分離出來；多次洗滌非特異性吸附之後，降低溶液的PH使星型聚合物將絡合的糖蛋白釋放，完成糖蛋白的富集。