人工合成多肽有機化合物及其用途的製作方法

2023-06-05 18:38:11

專利名稱：人工合成多肽有機化合物及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬有機化合物，主要涉及人工合成的多肽類有機化合物，尤其是關於人工合成的多肽有機化合物及其在製備藥物中的用途。
本發明提供的多肽有機化合物，包括a、b二種，能與西非單葉豆凝集素(GS-I-B4)特異性結合，溶於水，各胺基酸之間通過肽鍵相連。
本發明提供的多肽有機化合物a的胺基酸序列為NCVSPYWCEPLAPSARA，分子量為1864；多肽有機化合物b的胺基酸序列為 (其中第2位的Cys與第8位的Cys之間形成二硫鍵)，分子量為1862。
本發明的另一個目的是該人工合成的多肽有機化合物在製備抑制異種器官移植術中出現的超急性排斥反應的藥物中的用途。
本發明的優點有①本發明的多肽有機化合物，由於肽鏈較短，故可以用人工化學合成或基因工程的方法大量合成。以前者為例，可以得到大量較純的小肽。
②本發明的多肽有機化合物能與人體內預存的抗豬細胞抗原的天然抗體特異性結合，從而封閉它的作用，可以抑制豬器官移植至人體時發生的超急性排斥反應。
③本發明的多肽有機化合物與人體內預存的天然抗體的結合位點是特異性的，正好起到封閉抗體作用，從而避免了由於作用位點特異性不強而帶來的副作用。
④由於本發明的多肽有機化合物分子量較小，溶於水，開發成藥物後容易被機體利用而起效。
圖2、為多肽有機化合物抑制西非單葉豆凝集素(GS-I-B4)與豬紅細胞的凝集反應結果圖。
圖3、為多肽有機化合物抑制人血清中的天然抗體引起的豬紅細胞凝集反應結果圖。
實施例1用西非單葉豆凝集素(GS-I-B4)作為靶蛋白，用噬菌體展示的方法得到陽性噬菌體克隆噬菌體展示方法利用基因工程手段將合成的一組一定長度的隨機序列寡核苷酸片段克隆到特定表達載體中，使其表達產物以融合蛋白的形式呈現在絲狀噬菌體表面。由於肽庫中包含了該長度小肽的所有可能的胺基酸排列順序或其中的絕大部分，每一個噬菌體呈現其中的一種肽段，因而庫容量極大，易於篩選和擴增。用噬菌體肽庫感染大腸桿菌，使重組入噬菌體的隨機的寡核苷酸片段在大腸桿菌內複製，並在噬菌體的外殼蛋白中表達出來。然後，把靶蛋白包被在酶標板上。用此噬菌體肽庫與靶蛋白混合後，洗板。如果噬菌體上的外殼蛋白能與靶蛋白結合，就不會被洗掉。最後用親和洗脫液(蜜二糖)把噬菌體洗脫下來。連續這樣篩3-4輪，就能篩出與靶蛋白結合力較強的噬菌體。由於GS-I-B4可與Gal-α-1，3-Gal結合，可以得到與Gal-α-1，3-Gal空間結構相似的噬菌展示的小肽。測此噬菌體的DNA序列得到重組寡核苷酸的序列，亦知道了相應小肽的序列。然後可通過人工化學合成或基因工程的方法得到該多肽。本發明提供的多肽有機化合物包括a、b兩種，能與GS-I-B4特異性結合，溶於水，各胺基酸之間通過肽鍵相連。
本發明提供的多肽有機化合物a的胺基酸序列為NCVSPYWCEPLAPSARA，分子量為1864；多肽有機化合物b的胺基酸序列為 (其中第2位的Cys與第8位的Cys之間形成二硫鍵))，分子量為1862。
實施例2蜜二糖競爭性ELISA試驗試驗方法在4℃用每孔100μl的上述小肽(100μg/ml)包被96孔酶標板兩天，用5％BSA室溫封閉2小時，用PBS緩衝液洗板3次後，加入1％的人血清50μl和50μl不同濃度的蜜二糖至最終濃度分別為1.0mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/mL，反應1小時，依次用TBST和TBS洗板5次和3次，加入100μl蛋白A-HRP，反應30分鐘，依次用TBST和TBS洗板10次和3次，加底物TMB進行顯色，加100μl 1M H3PO4終止，用酶標儀測定450nm下的吸光度(OD450)。計算出抑制率＝(未加蜜二糖OD450一加入蜜二糖OD450)/未加蜜二糖OD450×100％。
試驗結果結果參見

圖1，蜜二糖能非常好的抑制人體血清中天然抗體與該小肽的結合，蜜二糖濃度達到0.005mg/ml時，抑制率可達50％，說明該小肽可以競爭性結合在蜜二糖與人血清中的天然抗體結合的位點。
以上實例說明了該多肽有機化合物與血清中的人天然抗體的結合位點是特異性的，正好起到封閉抗體作用，從而避免了由於作用位點特異性不強而帶來的副作用。
實施例3小肽抑制西非單葉豆凝集素(GS-I-B4)與豬紅細胞的凝集反應試驗方法先把製備好的新鮮3％豬紅細胞懸浮在pH7.4的磷酸緩衝液中備用。在V型血凝板的孔裡，每孔分別加入40μl濃度為5μg/ml的GS-I-B4和40μl 3％的豬紅細胞。然後加入40μl各種不同濃度的小肽，混合液在室溫下先震搖1分鐘，再靜置1小時後觀察凝集結果，不同濃度的蜜二糖作為陽性對照。判斷凝集標準為如果紅細胞沉澱到孔的底部，呈一邊緣光滑的圓點，顯微鏡觀察紅細胞呈現單個散在狀態，則此為沒有凝集。如果紅細胞形成一網絡，並不下沉到孔底，顯微鏡觀測紅細胞凝聚成網格狀態，此為出現凝集。試驗必須設空白、陽性對照。
結果參見圖2，A1-A2為空白對照，即用40μl豬紅細胞和磷酸緩衝液混勻後靜置1小時的結果。此結果為未出現凝集(紅細胞沉於底部，聚集於一點)。
圖2中，A3-A4為陽性對照，即用40μl 5.0μg/ml的GS-I-B4和40μl豬紅細胞混勻後靜置1小時的結果。此結果為出現凝集。(紅細胞形成一網絡，並不下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點)。
B，C兩條均為蜜二糖抑制豬紅細胞凝集的試驗結果，即1～4孔分別用磷酸緩衝液稀釋蜜二糖，使蜜二糖的濃度分別為1.563mMol/L，0.391mMol/L，0.098mMol/L，0.029mMol/L；然後每孔分別各加入40μl 5.0μg/ml的GS-I-B4和40μl豬紅細胞混勻後靜置1小時的結果。低達0.098mMol/L濃度的蜜二糖就能夠抑制GS-I-B4引起的豬紅細胞凝集。
D，E兩條均為合成小肽抑制GS-I-B4使豬紅細胞凝集的試驗結果，即1～4孔分別加入小肽濃度為0.214mMol/L、0.054mMol/L、0.014mMol/L、0.004mMol/L，然後加入GS-I-B4和豬紅細胞混勻後靜置1小時的結果。前二孔能抑制紅細胞的凝集，後二孔由於濃度太稀對紅細胞的凝集抑制作用不完全。低達0.054mMol/L濃度的合成小肽就能夠抑制GS-I-B4引起的豬紅細胞凝集。
結果說明因為凝集素GS-I-B4可以與豬細胞表面抗原結合引起豬紅細胞凝集，而此小肽能與GS-I-B4特異性地結合，從而阻斷其與豬細胞表面抗原Gal-α-1，3-Gal結合，使其不能使豬紅細胞凝集起來。
實施例4小肽抑制人血清與豬紅細胞的凝集反應試驗方法先把製備好的新鮮3％豬紅細胞懸浮在pH7.4的磷酸緩衝液中備用。在V型血凝板的孔裡，40μl小肽用磷酸緩衝液依次逐孔倍比稀釋後，每孔分別加入40μl的A型人血清(1∶20稀釋)和40μl 3％的豬紅細胞。然後把此120μl混合液在室溫下先震搖1分鐘，再靜置1小時後觀察凝集結果。加入的不同濃度的小肽測試其對人天然抗體介導的豬紅細胞凝集抑制作用，本試驗中採用蜜二糖作為陽性抑制劑對照。判斷凝集標準與實施例3相同，如果紅細胞沉澱到孔的底部，呈一邊緣光滑的圓點，則此為沒有凝集。如果紅細胞形成一網絡，並不下沉到孔底，此為出現凝集。試驗必須設空白、陽性對照。
試驗結果參見圖3，A1-A3為空白對照，即用40μl豬紅細胞和磷酸緩衝液混勻後靜置1小時的結果。此結果為未出現凝集(紅細胞沉於底部，聚集於一點)。
A4-A6為陽性凝集對照，即用40μl磷酸緩衝液稀釋20倍的A型人血清和40μl豬紅細胞混勻後靜置1小時的結果。此結果為出現凝集。(紅細胞形成一網絡，並不下沉到孔底呈一邊緣光滑的圓點)。
B，C兩條均為蜜二糖抑制豬紅細胞凝集的試驗結果，即1～6孔分別用磷酸緩衝液稀釋蜜二糖，使蜜二糖的濃度分別為1.563mMol/L、0.781mMol/L、0.391mMol/L、0.195mMol/L、0.098mMol/L、0.049mMol/L；然後每孔分別加入40μl稀釋20倍的A型人血清和40μl豬紅細胞混勻後靜置1小時的結果。低達0.391mM濃度的蜜二糖就能夠抑制GS-I-B4引起的豬紅細胞凝集。
D，E兩條均為合成小肽抑制豬紅細胞凝集的試驗結果，即1～6孔分別加入小肽濃度為7.126×10-3mMol/L、3.563×10-3mMol/L、1.782×10-3mMol/L、0.891×10-3mMol/L，0.446×10-3mMol/L，0.223×10-3mMol/L；然後加入A型人血清(稀釋20倍)和豬紅細胞混勻後靜置1小時的結果。前三孔能抑制紅細胞的凝集，後三孔由於濃度太稀對紅細胞的凝集抑制作用不完全。低達1.782×10-3mMol/L濃度的合成小肽就能夠抑制人血清中天然抗體引起的豬紅細胞凝集。
結果說明以上實例說明了此小肽預先能與人血清中存在的抗Gal-α-1，3-Gal抗體結合，使它失活。這樣此天然抗體就不能再與豬紅細胞上的Gal-α-1，3-Gal抗原結合，從而抑制豬紅細胞的凝集。
通過上面給出的部分實施例，說明了本發明提供的多肽有機化合物與人體內預存的天然抗體的結合位點是特異性的，正好起到封閉抗體作用，從而可以控制由於人天然抗體引起的超急性排斥，避免了由於作用位點特異性不強而帶來的副作用。
無需進一步詳細闡述，相信採用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度地應用本發明。因此，前面的優選具體實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發明的範圍。
本發明涉及的部分參考文獻1.Platt JL，Fischel RJ，Matas AJ，Reif SA，Bolman RM，Bach FH.Immunopathologyof hyperacute xenograft rejection in a swine-to-primate model.Transplantation1991；52214-2202.Galili U.Interaction of the natural anti-Gal antibody with α-galactosyl epitopesamajor obstacle for xenotransplantation in humans.Immunol Today 1993；14480-4823.Bach FH，Robson SC，Winkler H，Fanan C，Stuhlmeier KM，Wrighton CJ，HancockWW.Barriers to xenotransplantation.Nat Med 1995；1869-8734.Neethling FA，Koren E，Ye Y，Richards SV，Oriol R，Cooper DKC.Protection of pigkidney(PK15)cells from the cytotoxic effect of anti-pig antibodies byα-galactosyl oligosacchrides.Transplantation 1994；57959-9635.Ye Y，Neethling FA，Niekrasz M，Koren E，Richards SV，Martin M，Kosanke S，Oriol R，Cooper DCK.Evidence that intravenously administered α-galactosylcarbohydrates reduce baboon serum cytotoxicity to pig kindney cells(PK15)andtransplanted pig heart.Transplantation 1994；58330-3376.Scott JK，Smith GP.Searching for peptide ligands with an epitope library.Science1990；249386-3907.Bonnycastle LLC，Mehroke JS，Rashed M，Gong X，Scott JK.Probing the basic ofantibody reactivity with a panel of constrained peptide libraries displayed byfilamentous phage.J Mol Biol 1996；258747-7628.Kooyman DL，McClellan SB，Parker W.Avissar PL，Velardo MA，Platt JL，LoganJS.Identification and characterization of α-galactosyl peptide mimetic.Transplantation 1996；61851-8559.Norris JD，Paige LA，Christensen DJ，Chang C，Huacani MR，Fan D，Hamilton PT，Fowlkes DM，McDonnell DP.Peptide antagonists of the human estrogen receptor.Science 1999；285744-74610.Oldenburg KR，Loganathan D，Goldstein IJ，Schultz PG Peptide ligands for asurgar-binding protein isolated from a random peptide library.Proc.Natl Acad.Sci.USA1992；895393-539711.Platt JL，Vercellotti GM，Daimasso AP，Matas AJ，Bolman RM，Najarian JS，Bach FH.Transplantation of discordant xenograftsa review of progress.(1990)Immunol Today 1990；11450-456
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1.人工合成多肽有機化合物及其用途，其特徵是提供的多肽有機化合物包括a、b二種，能與西非單葉豆凝集素(GS-I-B4)特異性結合，溶於水，各胺基酸之間通過肽鍵相連。
2.如權利要求1所述的人工合成多肽有機化合物，其特徵是本發明提供的多肽有機化合物a的胺基酸序列為NCVSPYWCEPLAPSARA，分子量為1864。
3.如權利要求1所述的人工合成多肽有機化合物，其特徵是本發明提供多肽有機化合物b的胺基酸序列為 分子量為1862。
4.如權利要求3所述的人工合成多肽有機化合物，其特徵是本發明提供多肽有機化合物b的胺基酸序列，其中第2位的Cys與第8位的Cys之間形成二硫鍵。
5.如權利要求1所述的人工合成多肽有機化合物的用途，其特徵是該人工合成多肽有機化合物在製備抑制異種器官移植術中出現的排斥反應藥物中的用途。
全文摘要
本發明提供人工合成多肽有機化合物及其在移植領域中的應用，該多肽有機化合物包括a、b二種，能與西非單葉豆凝集素特異性結合，各胺基酸之間通過肽鍵相連。本發明的多肽有機化合物，因肽鏈較短，可由人工化學合成或基因工程的方法大量合成，因其分子量較小、溶於水，容易被機體利用而起效，從而可應用於抑制異種器官移植術中出現的超急性排斥反應的藥物的製備。本發明的多肽有機化合物能與人體內預存的抗豬細胞抗原的天然抗體特異性結合，從而封閉它的作用，可以抑制豬器官移植至人體時發生的超急性排斥反應，而且與人體內預存的天然抗體的結合位點是特異性的，正好起到封閉抗體作用，從而避免了由於作用位點特異性不強而帶來的副作用。
文檔編號C07K7/00GK1453291SQ0311708
公開日2003年11月5日 申請日期2003年5月19日 優先權日2003年5月19日
發明者詹金彪, 夏錚, 許林海, 嚴志焜, 王克夷 申請人:浙江大學