一種檢測膠基型無煙氣菸草製品中菸鹼釋放行為的方法
2023-07-02 20:27:26
專利名稱：一種檢測膠基型無煙氣菸草製品中菸鹼釋放行為的方法
技術領域：
本發明涉及菸草領域，具體講是涉及一種檢測膠基型無煙氣菸草製品菸鹼釋放行為的方法，通過該方法可以為研究或衡量膠基型無煙氣菸草製品的安全性和進行品質調控提供具體的數據支撐。
背景技術：
膠基型無煙氣菸草製品是一種添加菸草提取物的咀嚼型菸草製品。該類製品與捲菸的最大區別是屬於無煙氣菸草製品。使用時像嚼口香糖一樣，通過咀嚼使此類菸草製品中含有的菸鹼等菸草成分經唾液溶解後通過口腔黏膜被人體吸收。近年來，由於各國政府對公共場所吸菸行為的限制，使得無煙氣菸草製品的消費量呈逐年增加的趨勢，尤其是膠基型菸草製品，它既有口香糖的作用，又能滿足人體對菸鹼的需求。作為現階段捲菸的有效替代品，在咀嚼膠基型菸草製品時能夠令人產生與抽吸捲菸相同的滿足感。與此同時，使用膠基型菸草製品不會產生煙霧，能夠避免被動吸菸，既能降低公眾危害，又能降低對含食者自身的危害，具有替煙、控煙的功效。但是，目前關於該類產品的質量檢測與控制還缺少相關技術方法。菸鹼是菸草中重要的生物鹼，菸鹼釋放量是膠基型無煙氣菸草製品安全和品質的重要指標，通過菸鹼釋放實驗可以了解食用產品時的菸鹼吸收情況，進而可用於指導品質管理和產品開發。目前，對菸鹼釋放情況研究工作分兩種方式一種是體內實驗，檢測人體血液或尿液中的菸鹼變化情況。該方法實驗結果易受志願者個體生理差異及消費菸草製品的習慣影響，實驗不易控制且對人體傷害較大。另一種是體外實驗，模擬人體咀嚼膠基型菸草製品時菸鹼的釋放情況，自創裝置進行研究。體外實驗相對較為簡單，可控性強，實驗周期短，易於實現對菸鹼釋放的監測。
發明內容
本發明的目的正是針對目前膠基型無煙氣菸草製品菸鹼釋放檢測方法的缺失或不足，提出了一種檢測膠基型無煙氣菸草製品菸鹼釋放情況的方法，該方法可以檢測膠基型菸草製品的菸鹼釋放速率以及釋放程度，為研究和衡量膠基型無煙氣菸草製品安全性和進行品質調控提供技術支持。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的
本發明的檢測膠基型無煙氣菸草製品中菸鹼釋放行為的方法，能夠模擬膠基型菸草製品中的菸鹼在人體口腔咀嚼過程中的釋放情況，並對釋放量和釋放速率進行即時定量檢測，具體步驟如下
1)、體外菸鹼釋放與收集創建模擬膠基型無煙氣菸草製品在人體口腔中菸鹼釋放情況的模型，該模型包括人工唾液和模擬咀嚼機，即模擬人在使用膠基型菸草製品時的情況，使人工唾液在恆溫條件下不斷注入模擬咀嚼機，模擬咀嚼機通過對夾擠壓、轉動膠基型菸草製品的方式實現菸草製品和人工唾液的充分接觸和咀嚼攪拌，促使菸草製品中菸鹼充分釋放，並實時收集咀嚼過程中的菸鹼釋放液進行分析檢測；
2)、收集液及殘留樣品中菸鹼含量定量分析利用高效液相色譜儀實現對收集液及殘留樣品中菸鹼含量的定量分析；
3)、繪製體外菸鹼釋放曲線由菸鹼定量結果計算菸鹼累積釋放率，根據菸鹼累積釋放率，繪製菸鹼釋放曲線(利用Origin軟體繪製曲線。)。在本發明中，所述人工唾液組分包括三類化合物無機鹽類化合物(包括氯化鈉、 氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等)，有機化合物(包括檸檬酸、葡萄糖等)，生物活性酶蛋白(粘蛋白、溶菌酶、澱粉酶等)。具體配方如下氯化鈉0.85 mg/mL;氯化鉀0.35 mg/mL ；氯化鈣 0. 15 mg/mL ；磷酸二氫鉀 0. 18 mg/mL ；氯化鎂 0. 25 mg/mL ；檸檬酸 0. 06 mg/mL ；葡萄糖 0. 20 mg/mL -MM 0. 08 mg/mL ；_佔胃白(mucin) 2. 45 mg/mL ；(lysozyme) 0. 60 units/mL ； 澱粉酶(σ-amylase》· 50 units/mL ；酸性磷酸酶(acid phosphatase)0. 01 units/mL。加入粘蛋白等活性物質前，PH值用鹽酸或氫氧化鈉調節至6. 2 7. 5的某一值，室溫攪拌10 min後加入粘蛋白等活性物質，再室溫攪拌30 min即完成配製。人工唾液可以按照上述配方自行配置，也可通過市場渠道購買。本人工唾液的有益效果是使用本發明所制的人工唾液與膠基型無煙氣菸草製品混合咀嚼後，能夠模擬被測樣品化學成份在口腔分泌物作用下的釋放行為，與真實情況接近，為膠基型菸草製品化學成份的提取搭建統一的平臺，便於分析測定該類製品的化學成分及含量，進而客觀地評價該製品的品質及特點。所用的高效液相色譜儀中的液相色譜參數如下色譜柱為C18反相色譜柱，流動相為甲醇和0.05 M的磷酸鹽緩衝溶液，流速1 mL/min，柱溫為30°C;檢測器為紫外檢測器， 最大吸收波長λ· = 254 nm。所述C18反相色譜柱可以為Waters XTerra RP C18色譜柱， 也可以為Waters XTerra MS C18色譜柱或Kromasil C18色譜柱等。所述模擬咀嚼機包括由圓柱形水浴循環箱和環繞該循環箱設置的環形水浴循環箱構成的測試腔，在圓柱形水浴循環箱上坐放有用於盛放人工唾液及測試物的小碗，與電機轉動軸相連接的氣動夾子通過吊裝方式伸入碗腔中，進液管和出液管設置在碗腔兩側， 圓柱形水浴循環箱底面與氣缸連接並可在氣缸作用下升降。所述小碗外壁為圓柱形結構，嵌放在圓柱形水浴循環箱的圓柱形內凹腔中，以保證小碗內的環境溫度與人體溫度一致。氣動夾子由空氣壓縮機提供動力實現張開和夾持，氣動夾子的牙口為波浪形或者是鋸齒形，以模擬牙齒咀嚼動作保證咀嚼力；氣動夾子的牙口表面和小碗內表面塗覆有防粘塗層。氣動夾子的下邊緣為圓弧形，其弧度與小碗內表面的弧度相吻合，儘量保證氣動夾子在張合時與小碗內表面不留間隙。進液管和出液管分別通過電磁閥與雙泵頭蠕動泵相連接。氣動夾子和小碗的材質可以是不鏽鋼、聚四氟乙烯、環氧樹脂、鍍鎳碳鋼、尼龍棒寸。本發明的具體操作是先打開恆溫水浴循環系統，設置溫度37°C，等待一定時間，使測試腔內的溫度達到37°C後，開始測試動作。首先為防止測試過程中膠基型無煙氣菸草製品粘在氣動夾子上，可將膠基型無煙氣菸草製品用一層透水性尼龍布包裹，放入小碗中。 之後，升降氣缸上升，將圓柱形水浴循環箱連同小碗升至測試腔內，開啟蠕動泵，通過進液管向小碗中注入一定量的人工唾液。開啟氣動夾子和電機，使咀嚼動作開始，氣動夾子收縮，將被測試物體對夾，然後夾子鬆開，轉動一定角度，重複對夾動作。測試過程中，蠕動泵通過進液管定時、定量將新鮮恆溫的人工唾液注入到小碗內，通過出液管定時抽取人工唾液(菸鹼釋放液)進行分析檢測。到達系統設定時間後，電機停止轉動，氣動夾子張開，實驗結束。此時可將升降氣缸降下，取出殘留樣品，放入50 100 mL的錐形瓶中，加入少量正己烷，置於搖床上震蕩15 min，待膠基質樣品完全溶解後，再向其中加入20 50 mL混合磷酸鹽緩衝溶液，再次置於搖床震蕩30 min。菸鹼釋放液和殘留樣品萃取液過0.45 ym濾膜後，進入高效液相色譜儀進行定量檢測，根據定量結果計算菸鹼釋放程度和速率。菸鹼釋放程度和速率通過菸鹼隨時間的累積釋放率求得，菸鹼累積釋放率由一段時間的菸鹼累積釋放量除以樣品總菸鹼含量計算(樣品總菸鹼含量為測試時間內的菸鹼釋放總量與殘留樣品中菸鹼含量的總和)，並根據需要繪製膠基型無煙氣菸草製品菸鹼釋放曲線。本發明能夠模擬膠基型無煙氣菸草製品中菸鹼在人體口腔咀嚼過程中的釋放情況，並對釋放量和釋放速率進行即時定量，可以檢測膠基型無煙氣菸草製品的菸鹼釋放速率以及釋放程度，為研究衡量膠基型菸草製品安全和品質優劣提供具體技術數據支持。該檢測方法快速準確、重複性好，適用於各種規格膠基型無煙氣菸草製品的檢測，便於推廣。本發明所述檢測方法與人體消費膠基型無煙氣菸草製品的真實情況接近，靈敏度高，重複性好，檢測周期短，適用於不同行業不同目的研究和較大批量樣品的快速分析，可在菸草、醫藥等行業的普通化學分析實驗室推廣應用。
圖1為本發明的檢測流程圖。圖2為本發明中所用的對夾型模擬咀嚼機結構示意圖。圖2中各部件標號如下1.電機，2.出液管，3.氣動夾子，4.環形水浴循環箱， 5.圓柱形水浴循環箱，6.升降氣缸，7.支架，8.小碗，9.進液管，10.測試腔。圖3為菸鹼標準曲線。圖4為實施例1條件下菸鹼釋放曲線。圖5為實施例2條件下菸鹼釋放曲線。
具體實施例方式首先對模擬咀嚼機的結構及使用方法結合圖2予以描述該模擬咀嚼機的支架 (7)上固定有電機(1)、升降氣缸(6)和環形水浴循環箱(4)，電機(1)下端連接有氣動夾子 (3)，該氣動夾子由空氣壓縮機提供動力實現張開和夾持，升降氣缸(6)上端連接著圓柱形恆溫水浴循環箱(5)，其上固定著放置測試樣品的小碗(8)，此外，雙泵頭蠕動泵的進液管 (9)和出液管( 通過支架伸入到環形水浴循環箱圍繞的測試腔(10)內，固定在靠近小碗(8)內側邊緣處。使用該咀嚼機時，設定恆溫水浴循環系統溫度為37°C，並保持測試過程中測試腔(10)內溫度恆定在37°C的人體溫度。首先用一層透水性尼龍布將膠基型菸草製品包裹好放入小碗(8)中。之後，升降氣缸上升，將圓柱形水浴循環箱連同小碗(8)升至測試腔(10) 內，開啟蠕動泵，向小碗中注入5 30 mL恆溫37°C的人工唾液。開啟氣動夾子(3)和電機(1)，使咀嚼動作開始，氣動夾子收縮，將被測試物體對夾，然後夾子鬆開，在電機帶動下轉動一定角度，重複對夾動作。測試過程中，雙泵頭蠕動泵通過進液管電磁閥控制定時向小碗中注入新鮮的人工唾液，通過出液管電磁閥控制定時抽取人工唾液(菸鹼釋放液)，蠕動泵的流速為0. 5 20 mL/min。到達系統設定時間後，電機(1)停止轉動，氣動夾子(3)張開，實驗結束。此時可將升降氣缸(6)降下，取出殘留樣品。釋放液和殘留樣品中的菸鹼含量可通過高效液相色譜進行定量分析，根據定量結果計算菸鹼釋放程度和釋放速率，繪製膠基型無煙氣菸草製品菸鹼釋放曲線。以下結合實施例對本發明做進一步描述 實施例1
測試樣品Nicorette Classical 4mg Gum (Sweden)。人工唾液pH為6· 7，小碗中人工唾液的起始量為20 mL，蠕動泵的流速為20 mL/min，測試共進行60 min。分別在實驗進行 2 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、55 min時抽取菸鹼釋放液和補充新鮮人工唾液，抽取和補充人工唾液的量均為5 mL,按先取液後補充的順序進行；60 min時系統自動停止，此時蠕動泵抽取最後一份釋放液。取出殘留膠基樣品，放入100 mL錐形瓶中，加入5.0 mL正己烷，蓋上塞子，置於搖床上震蕩15 min, 待膠基質樣品完全溶解後，再向其中加入40 mL混合磷酸鹽緩衝溶液(pH = 6. 86)，再次置於搖床震蕩30 min，分液取下層緩衝溶液層。釋放液和殘留樣品萃取液中菸鹼的檢測採用高效液相色譜法，色譜參數如下色譜柱為Waters XTerra RP C18柱，流動相為甲醇和0. 05 M的磷酸鹽緩衝溶液(流動相中添加三乙胺，含量為0. 2 %，其作用是有效地改善菸鹼色譜峰的拖尾，保留時間變大；磷酸鹽緩衝溶液的PH = 5. 8)，其比例為8 92，流速1 mL/min，柱溫為30°C，進樣量10 yL，檢測波長為254 nm。首先，稱取一定量的菸鹼標準品(99. 7 %，Sigma)，採用流動相作溶劑，配製成濃度為 10.0，20.0，30.0，40.0，60.0，80.0，100.0，120.0 μ g/mL 的系列標準溶液，按上述色譜條件進行高效液相色譜分析。以菸鹼濃度為橫坐標，以紫外檢測器信號響應的峰面積值為縱坐標，繪製標準曲線(見圖3)。採用相同色譜條件對菸鹼釋放液和殘留樣品萃取液中菸鹼含量進行測定，根據測定結果計算菸鹼累積釋放率，繪製該菸草製品的菸鹼釋放曲線(見圖4)。從圖4中可以看出，該膠基型無煙氣菸草製品菸鹼前15 min釋放相對較快，15 min內的菸鹼釋放量已超過 50 %，15 min到60 min釋放速率明顯減慢，60 min內該產品的菸鹼共釋放了 79.5 %。實施例2
測試樣品:Nicotinell Fruit 4mg Medicated Chewing Gum (Germany)。人工唾液 pH 為6. 7，小碗中人工唾液的起始量為10 mL，蠕動泵以2. 5 mL/min的流速連續不斷地更新模擬咀嚼機內的人工唾液，測試共進行30 min。收集每2分鐘的菸鹼釋放液，實驗進行至觀 min時關閉蠕動泵，30 min時系統自動停止，此時手動採集最後一份釋放液。採用與實施例 1中相同的方法處理殘留樣品。用高效液相色譜儀檢測菸鹼釋放液和殘留樣品萃取液中的
6菸鹼含量，色譜條件同實施例1。根據定量結果計算菸鹼累積釋放率，繪製該菸草製品的菸鹼釋放曲線(見圖5)。從圖5中可以看出，該膠基型無煙氣菸草製品菸鹼前10 min釋放相對較快，10 min內的菸鹼釋放量已接近60 %，10 min到30 min釋放速率明顯減慢，30 min 內該產品的菸鹼共釋放了 82. 75 %。對比實施例1，該產品菸鹼釋放速率明顯快一些，其原因可能與膠基的配方有關，實施例1中樣品膠基的包埋緩釋作用要強一些，在咀嚼相當長的時間後，其膠基中仍然能夠檢測到菸鹼殘留。
權利要求
1.一種檢測膠基型無煙氣菸草製品中菸鹼釋放行為的方法，其特徵在於該方法能夠模擬膠基型菸草製品中的菸鹼在人體口腔咀嚼過程中的釋放情況，並對釋放量和釋放速率進行即時定量檢測，具體步驟如下1)、體外菸鹼釋放與收集創建模擬膠基型無煙氣菸草製品在人體口腔中菸鹼釋放情況的模型，該模型包括人工唾液和模擬咀嚼機，即模擬人在使用膠基型菸草製品時的情況，使人工唾液在恆溫條件下不斷注入模擬咀嚼機，模擬咀嚼機通過對夾擠壓、轉動膠基型菸草製品的方式實現菸草製品和人工唾液的充分接觸和咀嚼攪拌，促使菸草製品中菸鹼充分釋放，並實時收集咀嚼過程中的菸鹼釋放液進行分析檢測；2)、收集液及殘留樣品中菸鹼含量定量分析利用高效液相色譜儀實現對收集液及殘留樣品中菸鹼含量的定量分析；3)、繪製體外菸鹼釋放曲線由菸鹼定量結果計算菸鹼累積釋放率，根據菸鹼累積釋放率，繪製菸鹼釋放曲線。
2.根據權利要求1所述的檢測膠基型無煙氣菸草製品中菸鹼釋放行為的方法，其特徵在於所述人工唾液組分包括三類化合物無機鹽類化合物，有機化合物，生物活性酶蛋白。
3.根據權利要求1所述的檢測膠基型無煙氣菸草製品中菸鹼釋放行為的方法，其特徵在於利用Origin軟體繪製曲線。
4.根據權利要求1所述的檢測膠基型無煙氣菸草製品中菸鹼釋放行為的方法，其特徵在於所用的高效液相色譜儀中的液相色譜參數如下色譜柱為C18反相色譜柱，流動相為甲醇和0.05 M的磷酸鹽緩衝溶液，流速1 mL/min，柱溫為30°C;檢測器為紫外檢測器，最大吸收波長λ max = 254 nm。
5.根據權利要求4所述的檢測膠基型無煙氣菸草製品中菸鹼釋放行為的方法，其特徵在於所述C18反相色譜柱可以為Waters XTerra RP C18色譜柱，也可以為Waters XTerra MS C18色譜柱或Kromasil C18色譜柱。
全文摘要
一種檢測膠基型無煙氣菸草製品中菸鹼釋放行為的方法，其特徵在於該方法能夠模擬膠基型菸草製品中的菸鹼在人體口腔咀嚼過程中的釋放情況，並對釋放量和釋放速率進行實時定量檢測，具體步驟如下1)體外菸鹼釋放與收集；2)收集液及殘留樣品中菸鹼含量定量分析；3)繪製體外菸鹼釋放曲線。該方法可以檢測膠基型菸草製品的菸鹼釋放速率以及釋放程度，為研究和衡量膠基型無煙氣菸草製品安全性和進行品質調控提供技術支持。該檢測方法與人體消費膠基型無煙氣菸草製品的真實情況接近，快速準確、重複性好，檢測周期短，適用於各種規格膠基型無煙氣菸草製品的檢測，便於推廣。
文檔編號G01N30/02GK102507789SQ20111036443
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月17日 優先權日2011年11月17日
發明者宗永立, 張建勳, 張文娟, 慎龍舞, 曾波, 李鵬, 黃衛東 申請人:中國菸草總公司鄭州菸草研究院, 鄭州嘉德機電科技有限公司