一種轉化髮根農桿菌的三親雜交方法

2023-06-14 07:35:36 3

專利名稱：一種轉化髮根農桿菌的三親雜交方法
技術領域：
本發明涉及沒有染色體抗性標記的野生型髮根農桿菌的遺傳轉化，屬於生物技術 領域。
背景技術：
隨著基因工程技術的發展，農桿菌介導法在外源基因的遺傳轉化、作物品質的改 良，以及培育抗病、抗蟲、抗逆性較強的工程植物具有越來越廣泛的應用。目前應用的有根 癌農桿菌和髮根農桿菌2種。根癌農桿菌因介導外源基因插入的完整性好，但Ti質粒的 T-DNA上具有致病基因，外源基因表達易失活，基因的表達和植株再生不相容，且操作複雜， 取材限制大，轉化效率低，且必須要有成熟的再生系統，限制了它的廣泛應用；而髮根農杆 菌對植物的侵染是自然界中天然的遺傳轉化模式。髮根農桿菌iAgrobacterium rhizogenes)侵染植物傷口進入細胞後，Ri質粒的 TL-DNA上的rWA-D基因群和TR-DNA的tms基因能誘發被感染植物的受傷部位產生大量 的毛狀根，髮根農桿菌也可以同時轉化雙元Ti質粒，將Ti質粒上的DNA整合進植物基因 組，穩定地遺傳給後代，實現植物的轉基因。同時野生型髮根農桿菌Ri質粒的T-DNA不 影響植株的再生，而且轉化效率高，因此在植物遺傳轉化中的應用越來越多，並已在甘草 (Glycyrrhiza uralensis F.)、菸草(Ai'coiiaaa tabacum L.)、藍豬耳(Threwia fournieri L.)、鈍莨菪(辦O1SCJ^m1S muticus L.)等中獲得成功。將攜帶外源基因的雙元載體質粒導入農桿菌是農桿菌介導法進行植物遺傳轉化 的一項關鍵技術。化學法、電擊轉化法、三親雜交法是根癌農桿菌研究中將雙元質粒導入細 菌中常用的方法。化學法操作簡單，但重複性差，需要用到液氮等危險藥品和冷凍離心機等 貴重儀器，而且由於髮根農桿菌菌體生長慢、植物基因工程所用雙元表達載體較大，利用該 方法製備的髮根農桿菌感受態細胞往往不能取得滿意的轉化效率。電擊轉化法是利用外加 電場造成菌的跨膜電勢並形成細胞表面孔洞，從而攝取外源DNA。該方法轉化效率高於化學 法，但操作複雜，需要重複用超純水洗滌，對菌液需求量大，而且要用到電轉化儀、冷凍離心 機等貴重儀器。三親雜交法只需要在輔助菌的參與下就可以完成導入，是三種方法中效率 最高的，但需要受體菌具有相對於供體菌和輔助菌特殊的篩選標記，由於野生型髮根農杆 菌沒有染色體抗性標記而不能應用，因此很大程度上制約了髮根農桿菌在植物轉基因中的 應用。

發明內容
本發明的目的在於提供一種適合於沒有染色體抗性標記的野生型髮根農桿菌的 三親雜交轉化方法，加快野生型髮根農桿菌在植物轉基因工程中的應用。首先對三親雜交所需的供體菌、受體菌和輔助菌三類菌株進行分析，改變之前三
3親雜交方法應用受體菌攜帶的不同於供體菌和輔助菌的染色體的抗性標記進行的正向選 擇的方法，根據供體菌和輔助菌菌株自身的基因和營養缺陷，以缺陷型培養基做篩選標記， 進行三親雜交完成基因向野生型髮根農桿菌的遺傳轉化，並對菌株不同生長狀態以及不同 共培養時間下的轉化效率和轉化的假陽性率進行了調查。本發明具體實現過程如下
一種轉化髮根農桿菌的三親雜交方法，其特徵在於供體菌、受體菌和輔助菌三類菌株 中，供體菌和輔助菌菌株為營養缺陷型並帶有抗性標記，受體菌為野生型髮根農桿菌，以缺 陷型培養基加相應抗生素作篩選標記進行三親雜交，完成基因向野生型髮根農桿菌的遺傳 轉化。所述供體菌為大腸桿菌DH5a (pCAMBIA2300_attacin)，輔助菌為大腸桿菌 HBlOl (PRK2013)，DH5a和HBlOl的基因型為基因缺陷，即維生素Bl的營養缺陷，其 中所含質粒均帶有Kan抗性。所述缺陷型培養基為匪培養基。所述受體菌為野生型髮根農桿菌A4。轉化髮根農桿菌的三親雜交方法具體實施步驟如下
(1)分別挑取供體菌DH5a(pCAMBIA2300-attacin)、輔助菌 HBlOl (PRK2013)單菌落於 含Kan抗生素的LB液體培養基中震蕩培養，挑取野生型髮根農桿菌A4於YEB液體培養基 中震蕩培養；
(2)取等量的三種菌液離心，收集菌體，YEB培養基重懸並混合，再次離心，重複洗滌，最 後所得菌體用YEB培養基混勻；
(3)吸取混合液塗布在YEB平板上的無菌的微孔濾膜上，正置平板培養；
(4)取出濾膜，置入MM液體培養基中震蕩混勻1h，取50 PL菌液於含Kan抗生素的 MM固體平板培養基上，培養獲得單菌落；
(5)挑取單菌落MM液體培養基振蕩培養，鹼裂解法提取質粒；
(6)以提取的質粒DNA為模板，以rWB、iWC和aiiaci/ 基因的引物進行PCR擴增，獲 得相應的擴增產物，證明pCAMBIA2300-attacin成功轉化至髮根農桿菌A4 ；隨機挑取的30 個單菌落(約總數的1/6)，均為陽性克隆。上述步驟(2)和(3)中，三種菌分別培養至0D600 ^ 0. 6時取菌液，洗滌後共培養 2^3 h獲得最大的轉化效率。本發明的優點是利用三親雜交對無染色體抗性標記的野生型髮根農桿菌進行遺 傳轉化，解決了其他轉化方法效率不高的缺陷，且對於化學、物理轉化方法不明確菌株進行 三親雜交轉化具有重要的參考價值。


圖1為轉化獲得單菌落提取質粒的PCR ；
圖2為單菌落假陽性率的ro/B、ro/C和attacin基因的PCR擴增。
具體實施例方式圖1為轉化獲得單菌落提取質粒的PCR;其中M代表分子量標準，每條帶的大小(bp)標於左側，泳道1、3、5分別為rol B基因、rol C基因和attacin基因以 A4 (pCAMBIA2300-attacin)菌株提取的質粒做模板進行的PCR ；泳道2、4分別為rol B基因 和rol C基因的以大腸桿菌菌株質粒提取的模板進行的PCR ；泳道6分別為分別為attacin 基因的A4(pCAMBIA2300-attacin)菌株的質粒模板和大腸桿菌菌株質粒模板的PCR檢測； 圖2為單菌落假陽性率的ro/B、rolC和attacin基因的PCR擴增；其中A圖為rol B 基因PCR擴增；B圖為rol C基因的PCR擴增；C圖為attacin基因的PCR擴增；M代表分子 量標準，每條帶的大小(bp )標於左側。本發明轉化髮根農桿菌的三親雜交方法具體實施步驟如下
(1)分析各菌株的最小培養基和基因型野生型髮根農桿菌A4菌株的最小營養培養基 為匪培養基，該培養基不含有維生素Bl ；大腸桿菌DH5a和HBlOl的基因型為thH基因 缺陷，即維生素Bl的營養缺陷，在不含有維生素Bl的培養基上不能生長，分別以此菌株做 供體菌和輔助菌；
(2)分別挑取含重組雙元載體pCAMBIA2300-attacin的供體菌DH5a和含遊動質粒 PRK2013的輔助菌HBlOl的單菌落於IOml含50 mg/L Kan抗生素的LB液體培養基，同 時挑取野生型髮根農桿菌A4單菌落於10ml YEB培養基，26 °C，160 r/min震蕩培養至 0D600 ^ 0. 6時進行三親雜交，具體步驟為取三種菌各2 mL，5000 r/min離心3 min, YEB 培養基重懸並混合，再次5000 r/min離心3 min,收集菌體，並重複2次，所得菌體用150 μ L YEB液體培養基混勻；
(3)吸取50μ L混合液塗布於無菌的0. 45 mm微孔濾膜(直徑2. 5 cm)上，而後放置 在不含抗生素的YEB平板上，26°C正置平板培養3 h。取出濾膜，置入3 mL MM液體培養基 中，震蕩混勻1 h後取50 μ L塗布於含Kan抗生素的MM固體平板培養基上，28°C培養2 3 d，獲得單菌落；
(4)挑取匪固體平板培養基上生長的單菌落於含Kan抗生素的匪液體培養基振蕩 培養纊3 d，鹼裂解法提取質粒，並以提取的質粒DNA為模板，以野生型髮根農桿菌A4自 身的rWB、r0A基因和重組雙元載體攜帶的基因的引物進行PCR擴增，同時以 DH5a(pCAMBIA2300-attacin)和HBlOl (PRK2013)的混合菌液、以及A4菌以同樣方法提取的 質粒為模板，三個基因的引物進行PCR擴增做陰性對照，鑑定遺傳轉化結果。所用引物序列分別為
rolBF: 5』 -GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3』 ； rolBR: 5』 - GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3，； rolCF: 5』 -CTCCTGACATCAAACTCGTC-3』 ； rolCR: 5』 - TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3』 ； attacinF: 5』 -TTAGAAGAATTTCGAGAAGGAG-3，；
attacinR: 5，-ATGTCCAAGAGTGTAGCGTTG-3，，分別擴增 423 bp,626 bp 和 655 bp 的 目的產物，PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分析(見圖1、圖2)；
(5)在三種菌的OD600約0.2,0. 4,0. 6,0. 7,0. 9,1. 0時分別取樣進行共培養，分別培養 1 h、2 h、3h、4 h、5 h和12 h，在各種菌分別培養至對數生長期時進行共培養，共培養2 3 h 具有獲得203個轉化子，轉化效率最大；
(6 )隨機挑取匪固體平板培養基上單菌落30個(約總數的1 /6 )，rol込、rolC和a tacin基因的引物進行菌落PCR和1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所有菌落均為陽性克隆。
綜上所述，分析受體菌野生型髮根農桿菌A4的最小營養培養基，為不含有維 生素Bl的匪培養基，分析大腸桿菌DH5a和HBlOl為Ai-I基因缺陷，即維生素Bl 的營養缺陷，在不含有維生素Bl的培養基上不能生長，分別使用含有重組雙元載體 pCAMBIA2300-attacin的DH5a和遊動質粒PRK2013的HBlOl做野生型髮根農桿菌三親轉 化的供體菌和輔助菌；三種菌的單菌落分別在含相應抗生素的培養基中於26°C 160 r/min 進行震蕩培養，培養至0D600 - 0. 6時按常規三親雜交轉化方法進行遺傳轉化，轉化後混合 液均勻塗布於含重組雙元載體pCAMBIA2300-attacin的Kan抗生素的培養基平板進行篩 選，獲得轉化有attacin基因的野生型髮根農桿菌A4;該方法在各種菌分別培養至對數生 長期時進行共培養，共培養纊3 h具有最大的轉化效率，使用該方法獲得的單菌落全為陽性 菌落。
權利要求
一種轉化髮根農桿菌的三親雜交方法，其特徵在於供體菌、受體菌和輔助菌三類菌株中，供體菌和輔助菌菌株為營養缺陷型並帶有抗性標記，受體菌為野生型髮根農桿菌，以缺陷型培養基加相應抗生素作篩選標記進行三親雜交，完成基因向野生型髮根農桿菌的遺傳轉化。
2.根據權利要求1所述的轉化髮根農桿菌的三親雜交方法，其特徵在於供體菌為大 腸桿菌 DH5a(pCAMBIA2300-attacin)，輔助菌為大腸桿菌 HBlOl (PRK2013)，DH5a 和 HBlOl 的基因型為thi-Y基因缺陷，即維生素Bl的營養缺陷，其中所含質粒均帶有Kan抗性。
3.根據權利要求2所述的轉化髮根農桿菌的三親雜交方法，其特徵在於缺陷型培養基為匪培養基。
4.根據權利要求2所述的轉化髮根農桿菌的三親雜交方法，其特徵在於受體菌為野 生型髮根農桿菌A4。
5.根據權利要求1所述的轉化髮根農桿菌的三親雜交方法，其特徵在於包括以下步驟(1)分別挑取供體菌DH5a(pCAMBIA2300-attacin)、輔助菌 HBlOl (PRK2013)單菌落於 含Kan抗生素的LB液體培養基中震蕩培養，挑取野生型髮根農桿菌A4於YEB液體培養基 中震蕩培養；(2)取等量的三種菌液離心，收集菌體，YEB培養基重懸並混合，再次離心，重複洗滌，最 後所得菌體用YEB培養基混勻；(3)吸取混合液塗布在YEB平板上的無菌的微孔濾膜上，正置平板培養；(4)取出濾膜，置入MM液體培養基中震蕩混勻1h，取50 μ L菌液於含Kan抗生素的 MM固體平板培養基上，培養獲得單菌落；(5)挑取單菌落MM液體培養基振蕩培養，鹼裂解法提取質粒；(6)以提取的質粒DNA為模板，以r0/B、r^C和attacin基因的引物進行PCR擴增，獲 得相應的擴增產物，證明pCAMBIA2300-attacin成功轉化至髮根農桿菌A4 ；隨機挑取的30 個單菌落(約總數的1/6)，均為陽性克隆。
6.根據權利要求5所述的轉化髮根農桿菌的三親雜交方法，其特徵在於步驟(2)和 (3)中，三種菌分別培養至0D600 ^ 0. 6時取菌液，洗滌後共培養2 3 h獲得最大的轉化效 率。
全文摘要
本發明公開了一種轉化髮根農桿菌的三親雜交方法。其技術要點在於供體菌、受體菌和輔助菌三類菌株中，供體菌和輔助菌菌株為營養缺陷型並帶有抗性標記，受體菌為野生型髮根農桿菌，以缺陷型培養基加相應抗生素作篩選標記進行三親雜交，完成基因向野生型髮根農桿菌的遺傳轉化。本方法操作簡單，轉化效率高，突破了野生型髮根農桿菌沒有染色體抗性標記不能應用三親雜交轉化的局限，改變了野生型髮根農桿菌只能使用電轉化或化學方法製備感受態細胞進行轉化、操作複雜、轉化效率低的局面，將大大加快髮根農桿菌在植物轉基因工程的應用。
文檔編號C12N15/09GK101914521SQ20101025793
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月20日 優先權日2010年8月20日
發明者孔衛青, 楊金宏 申請人:安康學院